DNA酶1樣蛋白3基因及編碼蛋白在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的研究進展*

張乃丹，翟建昭，張 蘋 綜述，武永康，2△ 審校

四川大學華西醫(yī)院：1.實驗醫(yī)學科；2.門診部,四川成都 610041

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的特征是產(chǎn)生針對核抗原，如RNA和DNA的一組自身抗體，其中，B細胞對DNA和(或)染色質(zhì)耐受性喪失是SLE發(fā)病的重要機制。自身反應性B細胞受抗原刺激后增殖活化，參與表面抗原CD4+T細胞分化并激活固有免疫系統(tǒng)，包括漿細胞樣樹突狀細胞和分泌過量的Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)[1]。凋亡細胞DNA降解失活、嗜中性粒細胞胞外捕獲物和氧化線粒體DNA等先天免疫反應加劇B細胞活化，進一步誘導了SLE的發(fā)生與發(fā)展。通過對DNA酶1樣蛋白3(DNASE1L3)基因缺失的小鼠模型及兒童SLE患者家系病例的研究，結果顯示，DNASE1L3基因純合突變DNASE1L3:c.643delT與血清抗雙鏈DNA抗體相關,并與狼瘡性腎炎的高發(fā)病率相關[2-3]。由于缺乏性激素，兒童SLE發(fā)病可能提示遺傳因素占據(jù)主導地位，這提供了SLE致病基因遺傳多態(tài)性研究的新思路。本文將從DNASE1L3基因及編碼蛋白Dnase1L3的特征、在SLE發(fā)病機制中的作用，以及DNASE1L3遺傳學在SLE中的研究進展等方面進行綜述，為SLE遺傳因素與免疫細胞的相關研究提供參考依據(jù)。

1 DNASE1L3基因及編碼蛋白Dnase1L3的特征

1.1DNASE1L3基因和編碼蛋白Dnase1L3的結構特征 DNASE1L3基因位于人類染色體3p14.3,含有8個外顯子。該基因編碼脫氧核糖核酸酶1(Dnase1)家族中的蛋白3(Dnase1L3)，后者由275個氨基酸構成[4]。Dnase1L3的C端是螺旋結構(CTH)，并且含有核定位序列，核定位序列可加速細胞外Dnase1L3進入凋亡微粒細胞膜。研究顯示，Dnase1L3的C端結構在其發(fā)揮消化細胞外微粒相關染色質(zhì)和清除血清抗雙鏈DNA抗體等生物學效應方面顯示出重要作用[5-6]。見圖1。

注：SS表示信號序列；GPI表示糖磷脂酰肌醇錨定序列；PRD表示富脯氨酸域；NLS表示核定位序列；CTH表示C端螺旋。

1.2DNASE1L3基因和編碼蛋白Dnase1L3在自身免疫性疾病中的作用

1.2.1Dnase1L3發(fā)揮細胞外作用與自身免性疫病 Dnase1L3發(fā)揮細胞外和細胞內(nèi)作用共同預防自身免性疫病的發(fā)生。細胞外作用包括Dnase1L3與Dnase1形成阻斷質(zhì)粒轉染的嵌合蛋白，以及通過免疫細胞靶向DNA-蛋白質(zhì)復合物，降解中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)限制炎癥發(fā)作期間的組織損傷[7]。Dnase1L3通過清除SLE患者體內(nèi)來自NETs和凋亡細胞的核酸，參與核小體DNA碎片化，有效避免了濾泡樹突狀細胞激活并呈遞給自身反應性B細胞，抑制了抗雙鏈DNA抗體產(chǎn)生[6]。研究顯示，Dnase1L3缺陷與SLE患者體內(nèi)NETs降解延遲和血管損傷密切相關，導致狼瘡性腎炎病情加重[8]。

1.2.2Dnase1L3發(fā)揮細胞內(nèi)作用與自身免疫性疾病 Dnase1L3在細胞內(nèi)主要參與抑制環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cGAS)-干擾素激活蛋白(STING)途徑。SLE患者細胞核或線粒體DNA釋放到細胞質(zhì)，與cGAS作用生成環(huán)鳥腺苷酸(cGAMP)。cGAMP結合并激活STING，STING招募TANK結合激酶(TBK1)并轉位至核內(nèi)體,激活干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3),介導IFN-α/β產(chǎn)生[9]。Dnase1L3還通過調(diào)節(jié)高遷移率族蛋白B1(HMGB1)釋放，介導自身反應性B細胞增殖和活化[10]。活化B細胞產(chǎn)生HMGB1/DNA免疫復合物的累積效應促使炎癥細胞因子分泌增加，最終導致SLE的發(fā)生[11]。動物模型研究顯示，DNASE1L3基因缺陷導致小鼠巨噬細胞分泌大量白細胞介素(IL)-1β[12]。對缺乏DNASE1L3基因小鼠進行IFN-β注射,通過激活炎性小體，小鼠迅速發(fā)展出與SLE相關的多種免疫并發(fā)癥[5]。上述研究提示DNASE1L3基因和編碼蛋白Dnase1L3通過抑制cGAS-STING途徑調(diào)節(jié)B細胞，抑制促炎因子分泌，預防自身免疫性疾病的發(fā)生。

2 DNASE1L3基因和編碼蛋白Dnase1L3在SLE發(fā)病機制中的作用

2.1DNASE1L3基因和編碼蛋白Dnase1L3與B細胞異常 Dnase1L3在清除凋亡細胞DNA方面發(fā)揮重要作用，凋亡細胞DNA作為自身抗原，一方面通過TLR3、7、9激活B細胞，促進漿細胞激活和抗雙鏈DNA抗體的產(chǎn)生；另一方面，經(jīng)凋亡細胞DNA免疫后的B細胞可以刺激CD4+T細胞分化增殖，激活更多B細胞。動物模型顯示，肝臟組織中Dnase1L3清除循環(huán)微粒DNA，阻止DC細胞和Kupffer細胞通過toll樣受體(TLRs)和受體損傷相關分子模式(DAMP)介導CD4+T細胞分化[13-14]。DNASE1L3基因缺失的C57BL/6小鼠在SLE疾病早期出現(xiàn)了濾泡輔助性T細胞(Tfh)活化及脾臟中漿細胞數(shù)量增加[15-16]。Tfh活化產(chǎn)生CD40L、IL-21加速B細胞激活及自身抗體產(chǎn)生。研究表明,CD40與CD40L結合招募腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAFs)與腫瘤壞死因子受體相關細胞適配器蛋白、TLRs和IL-1受體，激活并引發(fā)絲/蘇氨酸蛋白激酶(MAPK),磷酸肌肽3-激酶(PI3K)和核轉錄因子κB(NF-κB)途徑及促炎因子表達,導致B細胞異常活化而產(chǎn)生自身抗體[17]。見圖2。

圖2 Dnase1L3與SLE患者B細胞異常的作用示意圖

2.2DNASE1L3基因和編碼蛋白Dnase1L3與細胞因子

2.2.1IL IL-4是由Ⅱ型輔助T細胞(Th2)產(chǎn)生，誘導Th2細胞因子轉換，有效抑制促炎因子IL-6、IL-17、IL-12、腫瘤壞死因子α的表達。研究顯示，IL-4是髓樣細胞和單核巨噬細胞中DNase1L3表達的重要調(diào)控因子[18]。IL-4誘導單核細胞衍生DC中DNase1L3 mRNA表達，通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/PI3K信號通路促進DNase1L3分泌到細胞外，降解凋亡細胞DNA,在組織穩(wěn)態(tài)和預防自身免疫性疾病中發(fā)揮了重要作用[3,19]。

2.2.2IFN-Ⅰ IFN-Ⅰ包括IFN-α和IFN-β，IFN-Ⅰ信號通路在人類和小鼠SLE中的致病作用已經(jīng)得到證實[20]。關于IFN-Ⅰ信號通路在SLE中的致病作用的研究集中在產(chǎn)生IFN-Ⅰ的細胞類型和IFN-Ⅰ信號轉導的靶細胞上[21]。對Dnase1L3缺陷小鼠研究顯示，Dnase1L3缺陷導致的DNA降解失活和抗原游離DNA暴露導致TLRs依賴的pDC活化，產(chǎn)生IFN-α。IFN-α升高通過外周T濾泡輔助細胞(ExFO-Th)途徑促進抗雙鏈DNA抗體形成細胞持續(xù)外分化，從而驅(qū)動SLE的病理效應[15]。由于pDC在體內(nèi)產(chǎn)生的IFN-Ⅰ難以檢測，DNASE1L3基因遺傳學證據(jù)和pDC體外IFN-Ⅰ驅(qū)動模型研究將會為治療SLE提供新的治療策略。

3 DNASE1L3基因遺傳學在SLE中的研究進展

DNASE1L3基因多態(tài)性與自身免疫性疾病易感性相關，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、強直性脊柱炎和血管炎等，見圖3。截至2020年5月，關于DNASE1L3基因多態(tài)性與SLE相關研究的文獻數(shù)量明顯多于其余各類疾病，提示充分研究DNASE1L3基因多態(tài)性與SLE發(fā)病機制的關系有望為治療SLE帶來新的靶點。

注：橫軸表示PubMed檢索到的文獻數(shù)，縱軸表示與DNASE1L3基因相關的疾病種類。

3.1DNASE1L3基因多態(tài)性與SLE 研究顯示DNASE1L3基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點與SLE發(fā)病具有一定的相關性，特別是在DNASE1L3基因缺失的小鼠模型和SLE家系中[15,22]。大部分疾病相關SNP位點位于 DNASE1L3基因編碼區(qū)上、下游或附近內(nèi)含子區(qū)域，提示這些基因位點突變可能通過與相鄰外顯子作用，干擾該基因的調(diào)控進而影響Dnase1L3蛋白的表達。關于DNASE1L3基因甲基化和組蛋白修飾的研究尚未明確，提示DNASE1L3基因表觀遺傳修飾功能還需進一步的研究。

有研究采用全基因組關聯(lián)分析的方法對沙特阿拉伯地區(qū)兒童SLE的7個家系進行DNASE1L3基因測序，研究顯示在DNASE1L3 (NM_004944.2)中發(fā)現(xiàn)c.289_290delAC (rs751206379)純合突變與SLE疾病易感性密切相關，該突變屬常染色體隱性突變，影響了Dnase1L3酶活性功能；自噬酶分析顯示rs751206379無效突變與兒童狼瘡性腎炎相關，患者臨床血清學表現(xiàn)為抗雙鏈DNA抗體陽性、低補體(C)3和C4；該研究指出，DNASE1L3基因多態(tài)性可能影響PXK基因編碼蛋白的表達[23]。PXK基因位于3p14.3，并且DNASE1L3基因是PXK上游140 kb的唯一基因[24]。該研究為SLE發(fā)病機制的研究提供了新視角，即導致細胞內(nèi)雙鏈DNA 或RNA傳感通路異常調(diào)節(jié)和激活的單基因突變可能導致異常IFN-Ⅰ產(chǎn)生，隨后促進自身免疫炎性反應和自身抗體的產(chǎn)生。

2013年OZ?AKAR等[25]采用Affymetrix 5.0芯片進行全基因組SNP基因分型后證實，來自土耳其地區(qū)的兒童SLE家系中3例患者檢出c.289_290delAC純合突變。值得注意的是，3例患者在確診為SLE之前出現(xiàn)低補體血癥蕁麻疹性血管炎的臨床表現(xiàn)[26]。SNP基因分型鑒定了新的突變位點c.320+4delAGTA(rs766912371)，該突變位點位于內(nèi)含子3，導致多肽序列中第78位天冬酰胺到第107位賴氨酸發(fā)生了缺失突變，Dnase活性分析顯示rs766912371突變與Dnase1L3活性降低有關[25]。隨后，UEKI等[27]采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)技術在3個種族(亞洲人、非洲人和高加索人)共計1 752例SLE患者中檢測并計算了DNASE1L3基因每個SNP的小等位基因頻率和雜合度，結果鑒定出DNASE1L3基因的5個功能突變位點：rs145888358、rs146805633、rs141477807、rs1472 19402和rs148314913，見表1。上述位點突變與Dnase1L3活性顯著降低有關[29]。由于這些位點變異編碼的氨基酸位于功能關鍵氨基酸殘基附近，關于DNASE1L3基因與SLE靶基因的相互關系需要進一步研究證實。

3.2微小RNA(miRNA)調(diào)節(jié)DNASE1L3基因表達調(diào)控 miRNA是具有調(diào)控功能的非編碼RNA，通過細胞核內(nèi)轉錄剪切、輸出到細胞質(zhì)并最終成為成熟miRNA。成熟miRNA與RNA誘導沉默復合物結合，誘導靶mRNA剪切或阻止其翻譯對靶基因進行表觀修飾，進一步影響靶基因表達和信號通路傳導，與DNASE1L3基因有關的miRNA研究見表2。研究顯示，miR-1184參與了通過轉化生長因子(TGF)-β途徑控制DNA雙鏈斷裂的修復過程[30]。關于miR-142-3p/5p的研究顯示，B細胞淋巴瘤6蛋白通過上調(diào)CD4+T細胞中的H3K27me3和下調(diào)H3K9/K14ac抑制miR-142-3p/5p的表達，導致T細胞過度活躍和B細胞過度刺激，促進SLE的發(fā)生[31]。尿液中miRNA的研究顯示，miR-335和miR-146a在狼瘡性腎炎患者中表達上調(diào)，并且miR-146a具有區(qū)分活動性狼瘡性腎炎的效能[32]。

表1 DNASE1L3基因中SNP的研究位點及功能評價

表2 DNASE1L3基因中miRNA的研究位點相關研究信息

3.3Dnase1L3與細胞游離DNA 細胞游離DNA是循環(huán)游離DNA或者釋放到血漿中的降解DNA片段，主要來源于凋亡和壞死細胞、移植物或胎兒游離DNA及自主激活釋放的DNA。目前已經(jīng)廣泛用于產(chǎn)前無創(chuàng)檢測、器官移植狀態(tài)監(jiān)控及無創(chuàng)腫瘤DNA研究等方面[34]。Dnase1L3作為清除凋亡細胞的重要酶類,Dnase1L3缺陷小鼠模型顯示,Dnase1L3作為內(nèi)切酶，首先在對乙酰氨基酚誘導的壞死肝細胞中生成細胞游離DNA，胱天蛋白酶激活的Dnase和Dnase1L3協(xié)同產(chǎn)生細胞游離DNA用于抗Fas介導的肝細胞凋亡[35]。另有研究顯示,在Dnase1L3缺陷小鼠中出現(xiàn)血漿細胞游離DNA片段的畸變。這種畸變包括120 bp以下增加的短DNA分子及血漿DNA末端基序的頻率異常,且畸變頻率與血清中抗DNA抗體水平呈正相關[36]。表明Dnase1L3作為細胞游離DNA的調(diào)節(jié)劑，可能對該酶阻止自身免疫性疾病的發(fā)生具有重要意義。

4 小 結

DNASE1L3基因突變及編碼蛋白Dnase1L3活性喪失可導致凋亡微粒中染色質(zhì)和DNA清除障礙，Dnase1L3是促進細胞凋亡相關斑點樣蛋白所必需的酶，Dnase1L3通過靶向caspase和募集域介導細胞凋亡和后續(xù)炎性因子釋放[37]。DNASE1L3基因突變和編碼蛋白Dnase1L3清除凋亡DNA功能異常，導致Tfh細胞產(chǎn)生的IL-4、IL-17、IL-21與活化B細胞相互作用，最終導致致病性自身抗體的產(chǎn)生。

近年來多項研究分別從動物模型、細胞實驗和人體標本的角度來探索DNASE1L3基因及編碼蛋白Dnase1L3在SLE發(fā)生、發(fā)展中的作用，但其具體機制及與SLE靶基因之間的相互關系尚未完全闡明。通過回顧不同地區(qū)、種族之間SLE家系及動物模型的研究顯示，DNASE1L3基因突變可能預示著SLE在不同年齡階段的致病機制具有較大差異，如兒童SLE與成人SLE。雖然單基因和孟德爾遺傳性狼瘡較為少見，但相關研究提示對SLE易感基因的研究應該充分考慮種族和地區(qū)的差異，應對患者進行年齡、性別、不同疾病表型等更為詳細的分層。同時，表觀遺傳修飾在SLE相關致病基因中的調(diào)控機制也是值得關注的問題。DNASE1L3基因的位點突變導致凋亡DNA和染色質(zhì)清除障礙，異常調(diào)控的表觀遺傳效應會對免疫細胞功能產(chǎn)生巨大影響。隨著分子診斷技術的不斷發(fā)展和對DNASE1L3基因及編碼蛋白Dnase1L3研究的不斷深入，DNASE1L3基因及編碼蛋白Dnase1L3在SLE疾病發(fā)生、進展及預后中的作用將有助于SLE靶向治療的應用。