3種抑菌劑對葡萄葉片霜霉病的影響差異分析

李戌彥，葛亞琪，楊忠義，張 霽，龐富強，孫玉榮，王梓皓，和宇亭，紀 薇

（山西農業(yè)大學園藝學院，山西太谷 030801）

葡萄（Vitis spp.）是世界四大水果之一，在多地均有栽植，2019 年全球產量達2 220.0 萬t[1]。由于葡萄有較強適應性，同時含有多種微量元素，可用于鮮食、釀酒、制干等各個行業(yè)，產生的經濟效益高，在我國被廣泛種植。現在山西省葡萄種植產業(yè)已經初具規(guī)模，在全國葡萄產業(yè)中，山西葡萄種植的面積和產量都位居前列。葡萄霜霉病（Plasmopara Viticola（Berk et Curt.）Berl.Et de Toni）是葡萄種植過程中最嚴重的病害之一，作為一種典型的單年流行病害，其在田間潛在發(fā)育期短，發(fā)病迅速[2]，病菌以卵孢子的形式在土中越冬，待第2 年春天外界條件合適時，卵孢子萌發(fā)會產生孢子囊和游動孢子，通過空氣傳播進入氣孔，經過一段潛育期后孢子囊進行再侵染[3]。在葡萄生長期，病菌可不斷侵染，只要氣候條件適宜，病菌就會大面積發(fā)生，造成嚴重后果[4]。

自1882 年MIRA 研制出的波爾多液殺菌劑在防治葡萄霜霉病方面取得了一定成效以來，人們雖然不斷改進化學農藥，并提高管理技術，但是仍然存在一些不足和弊端[5]。在實際生產中，防治主要還是以施用化學藥劑為主，但是化學農藥是非特異性的，殺死病菌的同時，還會有藥物殘留在葡萄果實表面，對環(huán)境污染極大，也會使益蟲遭受毒害[6-7]。隨著科技進步和人們生活水平的提高，采用生物菌劑作為霜霉病防治方法已經廣泛被葡萄生產行業(yè)所接受。利用生物菌劑來抑制葡萄霜霉病的方法無污染，安全有效，符合生態(tài)農業(yè)和綠色食品的農業(yè)發(fā)展趨勢。植物受到外界病原體的入侵后，自身會產生相應的抗病反應，并且通過復雜的生理生化效應保護自身[8]。葡萄受到霜霉病侵染并激活抗病機制后，會產生相應的病程相關蛋白，其中，過氧化物酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）作為關鍵的病程相關蛋白，是植物細胞低于活性氧傷害的主要蛋白，其酶活性的高低可以反映植株抗病性的強弱[9-10]。

在前期大量調查研究的基礎上，本研究選用益生菌生物菌劑、多粘類芽孢桿菌生物菌劑和枯草芽孢桿菌生物菌劑進行葡萄霜霉病的防治試驗，通過對葡萄葉片分別噴施3 種生物菌劑后，接種葡萄霜霉病孢子，觀察葡萄葉片發(fā)病情況，并測定SOD 和CAT 活性，研究3 種生物菌劑對葡萄霜霉病的抑菌作用，以期選出效果最佳的生物菌劑，為葡萄霜霉病防治和研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗對象 供試葡萄品種選用5 年生的克瑞森無核葡萄，取自山西農業(yè)大學園藝試驗站（37°25′21″N，112°34′45″E），葡萄采用常規(guī)管理。

1.1.2 供試藥劑 益生菌生物菌劑（山西大山宏濤環(huán)保科技有限公司）、多粘類芽孢桿菌生物菌劑（武漢科諾生物科技股份有限公司）、枯草芽孢桿菌生物菌劑（武漢科諾生物科技股份有限公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、過氧化氫等購自天津天力化學試劑有限公司；核黃素及甲硫氨酸等購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設備 紫外分光光度計（UV-2450，島津）、離心機（5430R，Eppendorf）、體視顯微鏡（SZX16，奧林巴斯）、顯微鏡（CX12，奧林巴斯）。

1.2 試驗方法

1.2.1 霜霉病病菌的制備 從田間采集3～4 片感染霜霉病的克瑞森無核葡萄葉片，用無菌水洗去葉片表面雜質和葡萄霜霉病孢子囊后，將葉片背面朝上放在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于20 ℃恒溫保濕培養(yǎng)；待新的霜霉菌孢子囊形成后，用毛刷輕輕刷下孢子囊，制成孢子懸浮液，并利用顯微鏡和血細胞計數板計算、調整孢子懸浮液濃度至1.6×105個/mL，存入4 ℃冰箱，備用[11-12]。

1.2.2 生物菌劑預處理 選取長勢中庸一致的樹體，分別從植株上部、中部、下部采取正常無病的克瑞森無核葡萄嫩葉8～10 片，無菌水沖洗后用直徑1.5 cm 打孔器避開葉脈均勻打孔，將打下的葉盤正面朝下擺放在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，備用[13]。根據使用說明書將多粘類芽孢桿菌、益生菌和枯草芽孢桿菌3 種生物菌劑稀釋后分別噴施在葉盤上，以噴施等量蒸餾水為對照，共4 個處理，每個處理進行3 組重復，每組20 個葉盤；噴施處理24 h 后，在葉盤中央接種20 μL 霜霉病孢子懸浮液；待24 h后將葉盤表面多余菌液用濾紙吸干，20 ℃恒溫保濕培養(yǎng)[14]。

1.2.3 培養(yǎng)觀察 開始培養(yǎng)后分別在1、3、5、7 d 后觀察記錄各處理葡萄葉盤發(fā)病情況，發(fā)病后挑取菌落在顯微鏡下觀察霜霉病形態(tài)，并在體式顯微鏡下觀察霜霉病侵染情況。其中，葉片表面長出白色菌絲則記為感染，褐化面積超過70%則記為死亡。

1.2.4 SOD 及CAT 活性測定 培養(yǎng)7 d 時采集葉盤，參照曲敏等[15]和陳軍等[16]的方法分別測定葉盤SOD 和CAT 活性。

1.3 數據分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0 進行數據處理及顯著性分析；采用Microsoft Office 2019 進行圖表的制作。

2 結果與分析

2.1 霜霉病菌的顯微觀察與確認

感染霜霉病后，葉片發(fā)生卷縮，背面出現不規(guī)則褐色斑點，并附著一層白色菌層（圖1-A）；正面出現黃色病斑，感染嚴重部位發(fā)生褐化甚至干枯（圖1-B）。挑取病葉背白色菌層，稀釋后在顯微鏡下觀察霜霉病孢子囊和孢子梗的形態(tài)，其中，孢子囊呈橢圓形或圓形，孢子梗呈圓柱狀，頂端有凸起（圖1-C）。人工接種葡萄霜霉病孢子，葉盤培養(yǎng)7 d后觀察發(fā)現，部分葉盤感染了霜霉病（圖1-D），在體視顯微鏡下觀察發(fā)現，葉盤背面長出白色的霜霉，菌絲之間相互連接，菌絲略呈透明狀，頂部孢子呈白色；同時觀察還發(fā)現，葉盤上霜霉病孢子及孢子梗分布于病葉霜霉病相同，因而，確定通過接種培養(yǎng)，霜霉病侵染了葉盤。

2.2 不同生物菌劑防治霜霉病效果

從表1 可以看出，在葉盤接種試驗中，隨著時間推移，4 個試驗組均有葉盤感染霜霉病，第7 天感病葉盤數量從高到低依次為噴施蒸餾水組＞噴施多粘類芽孢桿菌生物菌劑組＞噴施枯草芽孢桿菌生物菌劑組＞噴施益生菌生物菌劑組，且在培養(yǎng)過程中隨著感染程度的加深，噴施蒸餾水組、噴施多粘類芽孢桿菌生物菌劑組、噴施益生菌生物菌劑組均有出現死亡。

第1 天、第3 天噴施多粘類芽孢桿菌生物菌劑組、噴施益生菌生物菌劑組和噴施枯草芽孢桿菌生物菌劑組葉片均正常，第7 天噴施蒸餾水組正常葉盤數僅為12.33 個，顯著低于噴施益生菌生物菌劑組（16.33 個）與噴施枯草芽孢桿菌生物菌劑組（17.00 個）；3 個噴施生物菌劑組間正常葉盤數量差異不顯著。在第7 天蒸餾水組、多粘類芽孢桿菌生物菌劑組、枯草芽孢桿菌生物菌劑組和益生菌生物菌劑組感染霜霉病的葉盤數目分別為4.67、4.33、3.00、2.00 個，死亡葉盤數目分別為3.00、1.00、0、1.67 個。

表1 不同生物菌劑處理后葉盤霜霉病發(fā)病葉盤數量統(tǒng)計結果 個

2.3 SOD 活性變化

從圖2 可以看出，4 個處理下葡萄葉盤的SOD活性之間存在顯著性差異，由高到低依次為噴施蒸餾水組＞噴施枯草芽孢桿菌生物菌劑組＞噴施益生菌生物菌劑組＞噴施多粘類芽孢桿菌生物菌劑組，其活性分別為30.01、22.71、22.47、15.62 U/g，其中，噴施蒸餾水組葉盤SOD 活性顯著高于噴施多粘芽孢桿菌、噴施益生菌及噴施枯草芽孢桿菌。

2.4 CAT 活性變化

從圖3 可以看出，不同處理下葡萄葉盤CAT活性由高到低依次為噴施蒸餾水組＞噴施益生菌生物菌劑組＞噴施多粘類芽孢桿菌生物菌劑組＞噴施枯草芽孢桿菌生物菌劑組，其活性分別為34.89、28.50、27.40、25.04 U/（g·min）。其中，噴施蒸餾水組葉盤CAT 活性顯著高于其他3 組；噴施多粘芽孢桿菌生物菌劑組與噴施益生菌生物菌劑組和噴施枯草類芽孢桿菌生物菌劑組間葉盤CAT 活性差異不顯著；噴施益生菌生物菌劑組葉盤CAT活性顯著高于噴施枯草芽孢桿菌生物菌劑組。

3 結論與討論

葡萄霜霉病是葡萄病害中較嚴重的一種，發(fā)病初期會使葉片干枯，嚴重時令果穗脫落影響產量，給葡萄種植戶帶來巨大損失。本研究發(fā)現，感染初期葉盤出現黃色斑點，后來顏色逐漸加深。從采集的感病葉片上刮下灰白色霜層，在顯微鏡下觀察，可以看到病菌的孢子囊和孢子梗形態(tài)，其中，孢子囊呈橢圓形或圓形，孢子梗呈圓柱狀，頂端有凸起，與劉旭等[17]對霜霉病孢子囊的形態(tài)觀察結果一致。在葉盤培養(yǎng)過程中，感染霜霉病的葉盤背面長出白色霉層，在顯微鏡下觀察葉盤菌絲，其形態(tài)特征和田間自然病葉上的霜霉病菌絲形態(tài)相同，與邵信儒等[18]對霜霉病菌絲的觀察一致。

本研究利用葉盤培養(yǎng)法比較蒸餾水、多粘類芽孢桿菌生物菌劑、益生菌生物菌劑和枯草芽孢桿菌生物劑菌4 個處理對葡萄霜霉病防治效果，結果表明，與對照組相比，其他3 個試驗組感病葉盤數量都有減少，與陳浩等[19]和扈進冬等[20]的試驗結果一致。可以認為，噴施生物菌劑后葡萄感染霜霉病概率明顯降低，其中，枯草芽孢桿菌生物菌劑防治霜霉病效果更好，驗證了生物菌劑對于抑制葡萄霜霉病的良好效果。左瑞雨等[21]在研究中發(fā)現，多種芽孢桿菌的代謝產物具有很強的抗菌作用，對黃曲霉等菌類都有抑制作用。本研究中發(fā)現，枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌都會對霜霉病產生抑制作用，可能是因為這種代謝產物對霜霉病的繁殖起到了抑制作用。葉晶晶等[22]報道，枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌可以通過與病原菌進行營養(yǎng)競爭來抑制病菌發(fā)展，而本研究發(fā)現，益生菌與2 種芽孢桿菌的作用結果一致，也具有防治霜霉病的效果。本研究發(fā)現，在霜霉病侵染葡萄葉片3 d 時，噴施蒸餾水的葉盤已經開始出現感病葉片，但噴施生物菌劑的葉盤均未被感染，但5 d 時噴施菌劑的葉片也開始出現感染，可以看出，生物菌劑的持續(xù)效果至少在3 d 以上，在實際生產中可以在3～5 d 時進行第2 次用藥。

霜霉病侵染葉片后，會導致蛋白質、核酸結構改變，與此同時，植物體內各種酶的數量和活性開始發(fā)生變化，以催化進行各種生理代謝反應，進行自我防衛(wèi)[23]，其中，抗氧化酶可與病原菌發(fā)生相互作用，起到防止細胞被破壞，抵御病菌入侵的作用[24]。正常情況下，植物體內各種酶的含量與活性總是維持于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)，發(fā)生病菌侵染后，酶含量與活性就會發(fā)生變化。景嵐等[25]研究發(fā)現，在植物受到病害侵染初期，植物抗氧化酶活性的變化可以表征植物抗病能力；陳亮等[26]通過研究發(fā)現，不同抗性西瓜品種在受到枯萎病菌侵染后，植物體內的SOD、CAT 活性均會升高，因而，可以用抗氧化酶活性的變化反映植物對病原物侵染的反應。

本研究發(fā)現，接種霜霉病孢子后，噴施多粘類芽孢桿菌、益生菌及枯草芽孢桿菌后葉盤的SOD活性都低于未接種菌劑葉盤的SOD 活性。噴施生物菌劑可以抑制霜霉病對葉片的侵染，而對照組由于霜霉病快速侵染和繁殖，迅速激活植物防御機制，因而SOD 活性升高。接種菌劑葉盤的CAT 活性顯著低于對照組，因而推測噴施生物菌劑可以抑制霜霉病菌侵染植物葉片。劉麗等[27]通過研究不同抗霜霉病的葡萄發(fā)現，抗霜霉病品種防御機制更為敏感，在接種病菌后，保護酶活性上升快、增加多。本研究由于生物菌劑的施用，為植物葉片增加了一道防御，延長了內在抗氧化酶活性防御機制啟動的時間，降低了其抗氧化酶活性。

目前，化學農藥在農業(yè)生產中仍然有著重要作用，但化學農藥的缺點也十分明顯。近些年來，隨著科學技術的發(fā)展，已經研制出一些生物菌劑來防治霜霉病，如枯草芽孢桿菌和多粘類芽孢桿菌等均具有較好的防治效果，且使用方法簡單，在生產上應用也很普遍。本研究結果表明，益生菌、多粘類芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌3 種生物菌劑對葡萄霜霉病都有較好的防治效果，綜合比較發(fā)現，枯草芽孢桿菌生物菌劑對葡萄霜霉病抑菌效果最好，可根據當地氣候條件和發(fā)病情況，在病害發(fā)生前期或初期連續(xù)噴施1～2 次枯草芽孢桿菌生物菌劑，以達到更好的防治效果。