分子標記在連翹種質資源研究中的應用

昌秦湘，王曉芳，閆 釗，楊忠義，紀 薇

（1.太原學院園林科學研究所，山西太原 030012；2.太原學院藝術設計系，山西太原 030012；3.山西農業大學園藝學院，山西太谷 030801）

連翹（Forsythia suspensa）為木犀科連翹屬的落葉灌木，花金黃色、先葉開放，花期為3—4 月，單花期可持續20 d 以上且耐修剪[1-2]；連翹果殼為重要的中藥材，分為“青翹”和“老翹”2 種[3]，果實、根皮也可入藥。我國野生連翹資源分布廣泛，除華南地區外，其他地區均有種植[4]，尤其以延安、漢中、洛陽、臨汾、五臺、隴南、天水等秦嶺山脈中東部山區自然分布最廣。連翹作為一種兼備觀賞與藥用價值的樹種，目前在種植栽培技術[5]、分子生物代謝成分分析[6-7]等方面已開展研究。連翹作為山西重要道地藥材與“十大藥茶”之一，推進藥材標準化、規模化勢在必行。隨著連翹新品種的涌現與育種目標的提高，篩選優質高產的連翹種質資源意義重大，對研發連翹特異性分子標記技術提出更高的要求。

目前，分子標記在連翹種質資源及遺傳育種方面應用最廣的是隨機擴增多態性DNA（RAPD）、簡單序列重復（SSR）與簡單序列重復區間擴增多態（ISSR）。RAPD 是以PCR 技術為基礎、檢測DNA 多態性的第一代分子標記[8]；SSR、ISSR 是以PCR 為核心的第二代分子標記[9]，相比于RAPD 具有多態性豐富、穩定性高、操作簡單和重復性好等特點[10-11]。單核苷酸多態性（SNP）被認為是當前最具應用前景的分子標記，作為第三代分子標記比第一、二代分子標記工作效率更高，適用于大樣本檢測[12]。SNP 主要指單個核苷酸變異導致在基因組水平上的DNA序列多態性[13]，具有遺傳穩定性高、位點豐富、自動化分析、二態性及等位基因性等[14]特點。目前四類分子標記已在文冠果[15]、金銀花[16]、蘋果[17]、羽衣甘藍[18]、皺皮木瓜[19]、梨[20]等物種的品種鑒定、遺傳圖譜構建、親緣關系等方面有廣泛研究。因此，筆者將從以下幾個方面綜述分子標記在連翹種質資源與遺傳育種中的應用，以期為連翹遺傳育種研究提供參考。

1 品種鑒定應用

連翹因早春花朵繁密、抗逆性強、藥用價值高等特點，種植范圍擴大及新型品種的增多，導致同物異名或異物同名現象普遍，為連翹育種與生產帶來阻力。分子標記技術的研發有效提高連翹品種鑒定效率，目前RAPD、SSR、ISSR 技術得到了廣泛的應用。SHIM等[21]利用RAPD 技術對連翹金葉新品種進行DNA 指紋圖庫分析。

SUH 等[22]運用RAPD 技術對荷蘭、美國、韓國三地連翹雜交品種鑒定，發現由RAPD 標記生成的樹狀圖中，分為2 個簇，其中，CL-I 簇多數為F.×intermedia 雜交品種（Forsythia suspensa 和Forsythia koreana），CL-II 簇包含Forsythia europaea、Forsythia densiflora、Forsythia mandshurica、Forsythia japonica、Forsythia viridissima、Forsythia ovata 及其衍生物等。顧華等[23]用40 種RAPD 引物對山西5 個地區的11 個連翹品種區分開來。張璐[24]用RAPD 技術設計的30 對引物完成了對7 個連翹品種道地性的分類。何苗[25]運用SSR 技術對貫葉連翹進行位點分析，獲得了7 643 個位點，并設計了貫葉連翹特異性SSR 引物。FU 等[26]使用9 個微衛星（SSR）位點分析20 個連翹種群的差異，擴增出134 個等位基因來區分186 個品種。KIM等[27]選用93 個ISSR 擴增帶對5 個種群的連翹品種進行鑒定分類。李璐等[28]采用ISSR 分子標記對連翹25 個自然種群鑒定，用篩選的13 條引物共擴增出353 條清晰條帶，通過清晰條帶上的基因型區分195 個品種，為研究連翹種質資源與遺傳多樣性提供了參考。

2 遺傳多樣性和親緣關系的應用

遺傳多樣性反映種內性狀的差異及對環境適應、改造的潛力[9，29]。分子標記在連翹遺傳多樣性的應用，加快了其育種的效率與品種的改良。

2.1 遺傳多樣性研究

李漢偉等[30]運用RAPD 研究不同花柱類型連翹遺傳多樣性，為不同產地、花柱類型的連翹構建了指紋數據庫。FU 等[31]開發了第一套連翹微衛星標記來評估遺傳多樣性，從100 個SSR 基因座篩選出70 對引物，其中，11 個位點顯示出基因多態性。同時，在連翹種群遺傳多樣性參數中基因座的等位基因平均值為4.2，近交系數為0.212～0.500，發現種群中基因型不平衡，存在顯著的等位基因關聯。孟令芝[32]從設計的76 對SSR 引物中篩選出11 對具有多態性的引物進行連翹多樣性檢測，結果表明，不同地區連翹遺傳變異與產地、生長因子相關聯。WANG 等[33]從連翹已檢測到的3 199 個SSR 引物位點中，選取40 個位點研究16 個地區連翹的遺傳多樣性，結果發現，32 對清晰引物擴增帶，其中12對具有多樣性。湯正輝等[34]應用ISSR 分析河南連翹6 個自然種群的遺傳多樣性，結果顯示不同地區連翹的遺傳多樣性很高。KIM 等[27]采用ISSR 研究Forsythia ovata Nakai 的遺傳多樣性，平均每個ISSR 引物擴增數為6.6 個，該連翹品種的多樣性相對于其他灌木物種低。姜濤等[35]利用SLAF-seq 技術獲得1 809 741 個SNP 分子標記，對39 份連翹種質資源進行遺傳多樣性分析。LI 等[36]對中國15 個自然種群的連翹進行SNP 鑒定，獲得了1 120 232 個SLAF 基因座，每個SLAF 基因座的平均測序深度為11.51×，在這些SLAF 基因座中有1 021 768 個是多態的，其中的575 792 個高質量SNP 用于后續的群體遺傳多樣性分析。

2.2 親緣關系分析

顧華等[23]運用40 個RAPD 引物研究山西6 個地區11 種連翹品系的親緣關系，結果表明，不同區域的品系可劃分為2 個基因型，在DNA 水平上差異多樣化。吳婷[37]基于RAPD 擴增帶與UPGMA 法，對14 種連翹藥材進行親緣關系分析，按照不同遺傳相似系數劃分，得到山西地區連翹親緣關系較近且能區分于其他省份的連翹品種。夏偉[38]采用SSR研究4 種果型、不同產地連翹的親緣關系，果型分析表明，FC、TY、JFC 較LY 果型的親緣關系更近，LY 遺傳穩定性好，可將其推選為新型品種；地域分析表明，12 個連翹種群的基因交流比較密切，來源與地理距離無關。同時，還利用ISSR 分析了山西、河南省25 個連翹居群的遺傳變異性與遺傳距離，得出66.82%的變異性存在于居群內，遺傳分化明顯，遺傳距離與海拔、地形、壓力等環境、生態因子有關。王琳[39]通過ISSR 擴增引物分析不同省份連翹的親緣性，結果表明，4 個省份連翹的遺傳相似度在0.982 7～0.990 3，遺傳距離范圍為0.009 7～0.017 5，說明了遺傳相似度很高，尤其是山西與河南之間；遺傳距離的遠近與地理位置有一定的關聯，其中，山西與河北的遺傳距離最遠。

3 DNA 指紋圖譜的構建與關聯分析的應用

利用分子標記構建連翹的基因指紋圖譜，可選擇較少的引物，快速高效的鑒別更多的資源。馮帥[40]提取連翹中的DNA 得到ITS2 序列，以此作為DNA條形碼序列來辨別連翹的真偽。又基于PCR-RAPD分子標記，建立不同產地連翹的生物指紋圖譜，以便對連翹與金鐘花進行鑒別。吳婷等[41]通過45 條RAPD 引物對14 批不同產地的連翹進行篩選，結果獲得11 條多態性指紋位點數據，建立了DNA 指紋圖庫，以便對不同產地的連翹進行鑒別。

連翹自然群體進化中受選擇、突變、重組等影響，導致部分等位基因存在非隨機的關聯，可基于分子標記技術分析連翹生長調節、基因特異性表達等關聯應用。付子真[42]結合微衛星位點分析連翹遺傳結構，結果發現，連翹的遺傳多樣性低于其他種子植物，其中花粉傳播的基因流是影響連翹種群分化的關鍵因素，為連翹資源的利用與保護提供了依據。SUN 等[43]采用SNP 研究連翹中ENR（恩諾沙星）與耐ENR 菌株基因的差異表達，結果顯示，82個具有突變基因的SNPs 表達上調，31 個SNPs 表達下調。WANG 等[44]從連翹中獲取完整的葉綠體基因組，對檢測到的54 個SSR 分析葉綠體基因序列，發現葉綠體SSRs 大部分由單核苷酸和二核苷酸重復組成，分別被標記35 次和7 次；SSR 可能是特定于譜系標記，多數SSR 位于IGS 和內含子中，僅有5 個位于編碼區中，為后續研究連翹進化和遺傳多樣性提供了依據。

4 展望

近年來，4 類分子標記在連翹品種鑒別、遺傳多樣性、DNA 指紋圖庫的構建等方面開展了許多的研究，開發出一些與目標性狀相關的特異性分子標記，為連翹種質資源的保護與利用提供了理論依據。但分子標記在連翹方面的應用比較局限，如ISSR、SNP 技術的開發與應用處于起步階段，在連鎖圖譜構建、抗逆性QTL 定位及藥材質量評價、開花、種子性狀關聯分析等方面的應用較為缺乏。這也后續為連翹分子標記的應用提供廣大的研究空間，可基于新一代分子標記技術建立優質連翹品種資源庫、提高標記選擇的準確性和高效性，完善連翹優良性狀關聯分析與輔助育種等的應用。