2種中藥復方聯合植物乳桿菌對抗生素相關性腹瀉的緩解作用

郭 新，閆子鵬，李光輝，孟錦鑫，韓艷君，孫子龍

（山西農業大學動物醫學學院，山西太谷 030801）

抗生素已經被廣泛應用于人和動物各種疾病的預防和治療中，對畜牧業的發展也起到了一定的促進作用。然而，濫用或過量使用抗生素將會導致抗生素耐藥性、細菌易感性和反復感染的風險增加，威脅人體健康和生態環境安全[1]。抗生素相關性腹瀉是大多數抗生素長期應用的常見并發癥，特別是廣譜抗生素，如克林霉素、β-內酰胺類和第三代頭孢菌素[2-3]。腹瀉經常發生在豬、羊等養殖場，發病速度快、病程短，必須及時進行診斷和治療，否則將會導致動物大量死亡，給養殖業造成巨大的經濟損失[4]。

中藥因其具有安全、高效、低毒、不易產生耐藥性等優點，在動物疫病防控中發揮著越來越大的作用[5]。微生物發酵是中藥材的重要炮制手段之一，運用發酵的手段對中藥材進行處理，借助微生物與酶的作用，在一定的環境下，通過發酵可以改變其原有的性能，增強或產生新的功效，擴大治療范圍[6-8]。同時，發酵中藥還可以節省藥材資源，保護環境，增加中藥制劑的安全性以及質量控制[9]。

近年來，有很多研究顯示乳酸菌（Lactobacillus）在畜牧生產中以及中藥發酵中起著重要的作用，對動物機體的保健以及疾病的治療都有很好的效果。如在青貯飼料的發酵過程中添加乳酸菌，不僅可以有效地抑制有害菌的繁殖，而且也改善了飼料的發酵品質[10]。乳酸菌發酵黃芪多糖制劑應用在肉雞養殖上，可以提高肉雞的生長性能、改善肉雞腸道的微生物體系[11]。

本研究通過植物乳桿菌發酵補中益氣湯和參苓白術湯，對小鼠稀便率、腸道形態、腸屏障功能相關基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 的表達進行檢測，旨在通過利用中藥、益生菌或發酵中藥減輕由抗生素引起的腹瀉的研究提供一定理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗對象 無特定病原體（SPF）級體質量大小一致、健康的雄性ICR 小鼠（3 周齡）189 只，購自山西醫科大學試驗動物中心。

1.1.2 藥物和試劑 補中益氣湯（BZYQ）是由炙黃芪、黨參、炒白術、炙甘草、當歸、陳皮、升麻、柴胡8 味中藥組成；參苓白術湯（SLBZ）是由黨參、茯苓、炒白術、山藥、炙甘草、炒白扁豆、蓮子、炒薏苡仁、砂仁、桔梗、陳皮11 味中藥組成，藥材購自北京同仁堂藥店；頭孢曲松鈉購自北京索萊寶生物科技有限公司，植物乳桿菌CICC 21809 購自中國食品發酵工業研究院有限公司；Trizol、PrimeScriptTM試劑盒和SYBRRPremix Ex TaqTMII 試劑盒均購自大連Takara公司；蘇木精-伊紅染色試劑盒、無水乙醇、二甲苯、中性樹脂均自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設備 生化培養箱（哈爾濱東聯電子技術開發有限公司）、旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、生物組織包埋機（金華惠友儀器設備有限公司）、生物組織切片機（德國Leica 儀器設備有限公司）、生物組織攤烤片機（孝感市亞光醫用電子技術有限公司）、生物顯微鏡（日本Olympus 公司）、高精度移液槍（德國Eppendorf 公司）、超凈工作臺（北京昌平長城空氣凈化工程公司）、ND-2000 核酸蛋白測定儀（美國NanoDrop 公司）、Mx3000P 實時熒光定量PCR 儀（美國Stratagene 公司）。

1.1.4 中藥、菌液與發酵中藥 按照《中華人民共和國獸藥典》[12]中的比例稱取1.1.2 中藥材，加蒸餾水浸泡1 h，煎煮2 次，每次45 min，過濾去渣，合并濃縮藥液為1 g/mL；使用食品級碳酸鈉將pH 值調至6.5，即制得補中益氣湯和參苓白術湯。將植物乳桿菌菌株接種到已滅菌的乳酸細菌液體培養基（MRS）中，在37 ℃下培養24 h，制得益生菌液（LP），并將其以3%的接種量分別接種到補中益氣湯和參苓白術湯中，在37 ℃下發酵24 h，以達到107cfu/mL。即制得補中益氣湯發酵液（FBZYQ）和參苓白術湯發酵液（FSLBZ）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及給藥 適應性飼養7 d 后，小鼠隨機分成7 組，每組8 只，重復3 次。在空白對照組（BC）中，每天分別在9：00 和13：00 給小鼠灌胃0.3 mL 生理鹽水2 次；在頭孢曲松鈉組（CS，4 g/（kg·d））中，分別在9：00 和13：00 灌胃給小鼠0.3 mL 頭孢曲松鈉溶液和0.3 mL 生理鹽水；對于頭孢曲松鈉＋益生菌組（CS＋LP）、頭孢曲松鈉＋補中益氣湯組（CS＋BZYQ）、頭孢曲松鈉＋參苓白術湯組（CS＋SLBZ）、頭孢曲松鈉＋補中益氣湯發酵液組（CS＋FBZYQ）和頭孢曲松鈉＋參苓白術湯發酵液組（CS＋FSLBZ），分別于9：00 和13：00 通過灌胃給予小鼠0.3 mL 頭孢曲松鈉溶液和相應的0.3 mL 藥液。各組小鼠單獨分籠飼養，連續處理治療7 d，試驗期間各組飼養管理條件完全一致。在第1、4、7 d，分別記錄小鼠精神狀態和排便情況，在第8 天，對小鼠實施安樂死，將腸組織儲存在-80 ℃條件下，后續進行qRT-PCR。每組3 個樣品固定在4%多聚甲醛溶液中進行腸道組織病理學觀察。

1.2.2 稀便率測定 在13：00 灌胃2 h 內，分別統計每只小鼠的稀便數和總便數。稀便率為2 h 內每只小鼠所排稀便數與總便數的比值。

1.2.3 石蠟切片的制作及蘇木精-伊紅（HE）染色

將固定好的組織沿橫截面切成1 cm 左右的管狀，進行脫水、透明、浸蠟和包埋，使用切片機切成5 μm 厚的切片，攤片，烤片，之后用于HE 染色。

將制得的切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后；蘇木精染色，分化液分化，自來水沖洗藍化；再進行梯度酒精脫水；然后伊紅染色；高濃度酒精脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片，制得HE 染色切片。晾干后在顯微鏡下觀察各組小鼠十二指腸、空腸和回腸組織情況，并拍照保存。

1.2.4 十二指腸和結腸基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 相對表達量測定

1.2.4.1 引物設計與合成 由Primer 3.0 plus 設計的內參基因和目的基因的序列為GAPDH、AQP8和Claudin-1（表1），引物均由生工生物工程有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.4.2 RNA 提取和qRT-PCR 將0.5～1.0 cm 的十二指腸和結腸組織剪碎，將其加到1 mL 的Trizol中進行RNA 提取。RNA 的質量用核酸蛋白濃度測定儀（ND-2000）鑒定；然后使用PrimeScriptTM試劑盒反轉錄得到cDNA，使用SYBRRPremix Ex TaqTMII試劑盒進行qRT-PCR 擴增。反應條件為預變性95 ℃30 s；PCR 反應95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s；溶解曲線分析95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，并重復40 個周期。

1.3 數據分析

數據采用Graph Pad Prism 5.0 軟件進行統計學分析，結果均用平均數±標準差來表示。稀便率和基因相對表達水平采用方差分析（ANOVA），用Tukey's進行檢驗（P＜0.05 為差異顯著）。將GAPDH 作為內參，通過2-ΔΔCt法得出目的基因AQP8 和Claudin-1 的相對表達水平。

2 結果與分析

2.1 小鼠精神狀態觀察

試驗前，小鼠活潑好動，糞便正常；造模后，小鼠表現腹瀉、稀便、精神萎靡，毛色光澤度較差；而治療后上述癥狀有所緩解。

2.2 不同處理組小鼠稀便率的變化

從圖1 可以看出，與對照組相比，在第1、4、7 天頭孢曲松鈉組的小鼠稀便率均顯著上升（P＜0.05），表明模型成功建立。其中，第1 天，除益生菌組外，其他給藥組小鼠的稀便率與頭孢曲松鈉組相比均無顯著性差異（P＞0.05）；第4 天，除參苓白術湯組外，其他給藥小鼠的稀便率與頭孢曲松鈉組相比均顯著下降（P＜0.05）；第7 天，與頭孢曲松鈉組相比，發酵組小鼠稀便率顯著性下降（P＜0.05），且補中益氣湯發酵液組和參苓白術湯發酵液組的稀便率從第4～7 天持續顯著下降（P＜0.05）。

2.3 不同處理組小鼠小腸的形態學觀察結果

各組小鼠小腸形態如圖2、3、4 所示，可以觀察到對照組小鼠的十二指腸、空腸和回腸3 種小腸絨毛結構正常，絨毛與隱窩界限分明，基本完好，無明顯的病理變化（圖2-A、3-A、4-A）；而頭孢曲松鈉處理引起小鼠的十二指腸、空腸和回腸的腸黏膜損傷，表現出短而寬的絨毛，深的隱窩，不完整和斷裂、脫落的結構等病理變化（圖2-B、3-B、4-B）；其他各個給藥組均有不同程度的緩解效果，排列較為整齊緊密，結構相對完整。且發酵組的絨毛較長，緩解效果最好。

2.4 不同處理組小鼠十二指腸和結腸的基因表達量分析

各組小鼠的水通道蛋白AQP8 和緊密連接蛋白Claudin-1 在十二指腸和結腸中的mRNA 相對表達水平如圖5、6 所示，在十二指腸中，與對照組相比，頭孢曲松鈉組的AQP8 mRNA 的相對表達量顯著下降（P＜0.05）；與頭孢曲松鈉組相比，除參苓白術湯組，其他給藥組的AQP8 mRNA 相對表達量均顯著上升（P＜0.05）；相比頭孢曲松鈉組，補中益氣湯發酵液組的Claudin-1 mRNA 的相對表達量顯著升高（P＜0.05），其他處理組之間無顯著性差異（P＞0.05）。在結腸中，與對照組和益生菌組相比，頭孢曲松鈉組的AQP8 mRNA 的相對表達量顯著下降（P＜0.05），盡管其他給藥組都有上升趨勢，但差異均不顯著（P＞0.05）；同時Claudin-1 mRNA 的相對表達量各處理組間無顯著性差異（P＞0.05）。

3 結論與討論

為了觀察中藥、益生菌和發酵中藥對抗生素相關性腹瀉的緩解作用，本研究通過灌胃頭孢曲松鈉成功建立了小鼠腹瀉模型，它是廣譜的第三代頭孢菌素，廣泛用于治療胃腸道感染，但是重復使用會破壞腸道菌群的平衡，并引起腹瀉等副作用[12]。

越來越多的證據表明，益生菌可以有效地恢復和平衡腸道菌群，預防和治療抗生素引起的腹瀉[13]。郭元晟等[14]研究結果表明，乳酸桿菌可以促進肉雞小腸絨毛的生長發育，改善小腸的黏膜結構。還有一些研究發現，脾胃虛弱類型的比例在抗生素相關性腹瀉患者中最大，因此，在臨床藥物和日常飲食中，補氣、益氣類中藥被用于治療腸道疾病、增強免疫力、緩解疲勞和延長壽命等[15]。補中益氣湯、參苓白術湯作為經典的健脾益氣、澀腸止瀉方劑，經常被用來治療脾胃虛弱、腹瀉等[16-17]。在本研究中，用中藥、益生菌和發酵中藥連續治療7 d 后，腹瀉小鼠稀便率顯著下降，其中，補中益氣湯發酵液和參苓白術湯發酵液有持續緩解腹瀉效果，表明發酵具有一定的優勢。

腸道是重要的內臟器官之一，不僅可以消化和吸收營養，還可以保護人體免受病原微生物的侵害。在本研究中，通過HE 染色觀察發現，頭孢曲松鈉組小鼠小腸絨毛受損，短而寬，出現不完整和斷裂、脫落的結構，表明小腸的吸收功能和屏障功能受到嚴重損害[18]。小鼠腹瀉后，腸道中的水分增加，糞便軟化，在一定程度上刺激腸道黏膜，從而引起黏膜損傷。研究表明，中藥在治療腸黏膜屏障功能障礙中具有明顯的優勢[19]。小鼠灌服中藥、益生菌和發酵中藥后，腸絨毛損傷較輕，說明它們能夠減輕腹瀉對腸黏膜的刺激，對腸絨毛的完整性起到一定的保護作用。

腸上皮細胞通過緊密連接蛋白連接，從而調節腸道屏障通透性和上皮完整性。因此，緊密連接蛋白的穩態表達對于維持人類和動物健康至關重要[20]，其中，Claudin-1 是緊密連接結構中最關鍵的組成部分之一[21]。水通道蛋白（AQP）主要在胃腸道中表達，并且在一些生理和病理過程中發揮重要作用[22]，且遠端小腸和近端結腸是AQP8 表達的主要部位[23]。張文娣等[24]觀察顯示，與抗生素相關的腹瀉大鼠表現出胃腸道完整性下降和上皮組織不良，與對照組相比，水通道蛋白編碼基因、緊密連接蛋白異常表達和杯狀細胞數量減少。同樣地，本試驗研究發現，腹瀉小鼠的十二指腸和結腸中的AQP8 mRNA 表達水平顯著降低。在給予益生菌、補中益氣湯和補中益氣湯發酵液和參苓白術湯發酵液的小鼠中，AQP8 mRNA 表達水平得到了增強，十二指腸效果更明顯。Claudin-1 mRNA 表達水平在補中益氣湯發酵液中顯著上升。這些結果大致與觀察到的腸道形態結果一致，表明中藥、益生菌和發酵中藥在分子水平上顯示出有益的特性。

本研究結果表明，頭孢曲松鈉引起了腹瀉，導致了短而寬的絨毛以及腸結構的不完整和破裂，并且與腸屏障功能相關基因的AQP8 mRNA 和Claudin-1 mRNA 表達下降。但是，中藥、益生菌和發酵中藥均不同程度緩解了頭孢曲松鈉引起的變化，特別是發酵中藥顯示出更持久的緩解作用。研究結果為中藥、益生菌和發酵中藥在抗生素臨床使用上的進一步開發和應用提供了試驗依據和理論基礎。