基于代謝組學的不同劑型養心通脈膏對冠心病血瘀證的療效及機制探討

錢舒樂，馮宇，周曼麗，俞赟豐，羅曉欣，張家齊，簡維雄

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）引起的心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）已成為威脅人類健康的首要因素，且日益向年輕化發展。尋找有效抗AS的策略對于降低CVD 的發病率和病死率具有重要意義。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心病，coronary atherosclerotic heart disease，CHD）即“胸痹心痛”，其主要病機為心脈痹阻，病理變化為本虛標實、虛實夾雜，心血瘀阻證（以下簡稱血瘀證）是冠心病最常見的證型之一［1］。中醫學認為證具有動態演變的特點，本項目組既往研究證實，冠心病心血瘀阻證是一個“血瘀證前期”→“亞血瘀證期”→“心血瘀阻證期”流動的過程［2］。形成初期多為正氣虧虛，心失所養，不榮則病；病情持續進展則痰濁內聚，注入血脈，滯塞脈絡；日久營血瘀滯，痰瘀互結，沉積血府；最終痹阻心脈，心血瘀阻證形成。

冠心病患者需終身服藥，現階段冠心病的治療仍以西藥為主，但是明顯的副作用是患者良好依從性的一個考驗。隨著中醫藥事業的發展，中醫中藥的治療也逐步進入冠心病的防治中，但中藥煎煮方法復雜、湯劑口感不佳等都是臨床中面臨的問題。中藥材已從過去的中草藥、動物藥和礦物藥等，演變發展出超微顆粒劑，劑型的變化使中藥兼具療效和便捷成為可能，但是對于不同劑型的藥效眾說紛紜。目前對于顆粒劑膏方的研究有限，為數不多的研究尚無法排除不同中藥本身所存在的影響因素，故本研究通過觀察不同劑型的中藥膏方對冠心病血瘀證大鼠的作用，利用客觀化的指標，評判不同中藥劑型膏方之間的療效，并對其治療機制進行探討。

1 材料

1.1 動物模型

50 只SPF 級雄性SD 健康大鼠［質量合格證編號：SYXK（湘）2019-0009］，體質量（250±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，于湖南中醫藥大學SPF級動物實驗室喂養，在人工調控的環境中飼養（溫度：22～26 ℃、濕度：50%～70%），自由飲水和飲食，定期更換墊料，消毒籠具。適應性喂養1 周后用于實驗。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

甲醇、甲酸、水、乙腈（CNW 公司）；L-2-氯苯丙氨酸（上海恒創生物科技有限公司）；所有化學藥品和溶劑均為分析純或色譜純。

1.2.2 儀器

全自動樣品快速研磨儀（JXFSTPRP-24/32，上海凈信實業發展有限公司）；超聲波清洗機（SB-5200DT，寧波新芝生物科技有限公司）；臺式高速冷凍離心機（TGL-16 MS，上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；冷凍濃縮離心干燥器（LNG-T98，太倉市華美生化儀器廠）；高分辨質譜儀（QE plus，賽默飛世爾科技公司）；高效液相色譜儀（Dionex U3000 UHPLC，賽默飛世爾科技公司）；色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）（Waters）。

2 方法

2.1 動物造模與分組

2.1.1 造模

按照相關文獻資料以及本課題組前期研究造模方法［2-6］，分三個階段復制冠心病心血瘀阻證大鼠模型。

第一階段：“血瘀證前期”大鼠模型的建立。首先高脂飼養法復制高脂血癥大鼠模型。飼料配制：3%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙基硫氧嘧啶，5%白糖，10%豬油，81.3%基礎飼料。壓制成高脂飼料，進行飼喂，第8 天予以維生素D3 溶液灌胃（30 萬IU/kg），第15 天時再次用維生素D3 溶液灌胃（30 萬IU/kg），第22 天時繼續用維生素D3溶液灌胃（20萬IU/kg）。

第二階段：“亞血瘀證期”大鼠模型的建立。將第一階段成模大鼠持續高脂飼料喂養至第12周。

第三階段：“心血瘀阻證期”大鼠模型的建立。在第二階段的基礎上，予以皮下多點注射異丙腎上腺素（5 mg/kg），連續1周，記錄注射異丙腎上腺素前后大鼠心電圖，以心電圖J點或ST 段抬高或壓低≥0.1 mV 為成模標準。

大鼠飼養期間，飼料均于每天早上一次性給予，24 h 自由飲水；正常對照組（F）大鼠予以普通飼料喂養，其余大鼠造模全過程以高脂飼料喂養。

2.1.2 分組與給藥

第三階段成模后大鼠（造模期間死亡10 只）采用隨機數字表隨機分4組（每組8只）用于藥物干預實驗。分別為：蒸餾水干預的模型對照組（G）、顆粒劑養心通脈膏方干預的顆粒膏方組（KL）、傳統飲片養心通脈膏方干預的傳統膏方組（CT）、養心通脈方湯劑組干預的中藥湯劑組（E），實驗初預留的大鼠（8 只）作為正常對照組（F）。G 組繼續高脂飼料喂養，其余組別普通飼料喂養。每日固定時間灌胃1次，療程21 d。

中藥湯劑組（E）：養心通脈方灌胃（人參、丹參、桂枝、枳實和澤瀉等）。中藥飲片由廣東一方制藥有限公司提供，每劑中藥分2 次煎煮400 mL 后再濃縮至40 mL。

顆粒膏方組（KL）：顆粒劑養心通脈膏由廣東一方制藥有限公司提供，將膏劑加蒸餾水配制成與湯劑等濃度藥液。

傳統膏方組（CT）：傳統飲片養心通脈膏由廣東一方制藥有限公司提供，將膏劑加蒸餾水配制成與湯劑等濃度藥液。

模型對照組（G）：按等量蒸餾水灌胃。

正常對照組（F）：普通飼料自由飲食，自由飲水。

根據《實驗動物學》中灌胃的參考劑量：大鼠灌胃容積為1 mL/100 g，人與大鼠等效劑量換算為人∶大鼠=1∶6.25。中藥則按成人（50 kg）每日每劑服用量400 mL按比例濃縮后灌胃。

2.2 樣本采集與處理

第21天灌胃結束后，禁食24 h，稱取各組大鼠體質量。異氟烷呼吸麻醉大鼠，進行心電圖檢測，隨后解剖大鼠取下腹主動脈及左心室心肌于凍存管中，置于-80 ℃冰箱待測。

2.3 檢測條件

本次實驗的分析儀器為Dionex U3000 UHPLC 超高效液相串聯QE plus 高分辨質譜儀組成的液質聯用系統。

2.3.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：45 ℃；流動相：A 為水（含0.1%甲酸），B 為乙腈（含0.1%甲酸）；流速：0.4 mL/min；進樣體積：2 μL。洗脫梯度見表1。

表1 洗脫梯度

2.3.2 質譜條件

離子源：ESI；樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式。質譜參數見表2。

表2 質譜參數

2.4 生物樣品處理方法

實驗操作步驟如下：①精確稱取30 mg 組織樣本到1.5 mL EP 管中，加入內標（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置）20 μL，加入400 μL 甲醇-水（V∶V=4∶1）；②加入2 個小鋼珠，在-20 ℃冰箱中預冷2 min 后，放入研磨機中研磨（60 Hz，2 min）；③冰水浴超聲提取10 min，-20 ℃靜置30 min；④離心10 min（13 000 rpm，4 ℃），取300 μL 上清液裝入LC-MS 進樣小瓶中揮干；⑤用200 μL 甲醇-水（V∶V=1∶4）復溶（渦旋30 s，超聲3 min）；⑥-20 ℃下靜置2 h；⑦離心10 min（13 000 rpm ，4 ℃），用注射器吸取150 μL 的上清液，使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后，轉移到LC 進樣小瓶，-80 ℃下保存，直到進行LC-MS分析。⑧質控樣本（QC）由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，QC的體積與樣本相同。所有提取試劑使用前均在-20 ℃進行預冷。

2.5 數據處理方法

數據預處理在進行模式識別之前，原始數據經代謝組學處理軟件Progenesis QI v2.3 軟件（Nonlinear Dynamics，Newcastle，UK）進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化，其主要參數：precursor tolerance：5 ppm/10 ppm（自建庫）；product tolerance：10 ppm/20 ppm（自建庫）；product ion threshold∶5%。

對提取到的數據，刪除組內缺失值均（0值）＞50%的離子峰，并將0 值以最小值的一半替換，并根據化合物定性結果打分（Score），對定性得到的化合物進行篩選，篩選標準為36 分（滿分60 分），36 分以下視為定性結果不準確并刪除。

多元統計分析先采用無監督的主成分分析（PCA）觀察各樣本之間的總體分布和整個分析過程的穩定性，然后用有監督的正交偏最小二乘法分析（OPLSDA）來區分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。

3 結果

3.1 大鼠一般情況

造模期間，大鼠逐漸出現精神倦怠、反應遲鈍等情況，成模的血瘀證大鼠毛色偏黃、枯槁無光澤，精神萎靡，活動減少，呼吸稍快，喜蜷縮成團，偶有個別狂躁，部分大鼠肢端爪甲色紫暗。藥物干預后，顆粒膏方組、傳統膏方組、中藥湯劑組大鼠精神逐漸好轉，活動量增加，反應能力及進食情況可見恢復趨勢，組間未見明顯行為差異。正常對照組大鼠始終毛色光澤，反應靈敏，活動及飲食均正常。

3.2 心電圖

模型對照組心電圖顯示J點下移約0.1 mV，提示心肌缺血；顆粒膏方組和傳統膏方組心電圖基本成竇性心律，J點無明顯變化，無明顯心肌缺血表現。見圖1。

圖1 各組心電圖

3.3 HE染色

模型對照組的血管內膜結構破壞，內彈性膜崩解斷裂，中膜軟骨化破壞嚴重，鈣化明顯甚至可見空腔結構，內、中、外膜結構不清晰。顆粒膏方組和傳統膏方組的主動脈血管內、中、外膜結構基本完整、層次分明，彈性纖維結構清晰。見圖2～圖4。

圖2 模型對照組主動脈HE染色圖（從左至右依次為×40，×100，×200，×400）

圖3 顆粒膏方組主動脈HE染色圖（從左至右依次為×40，×100，×200，×400）

圖4 傳統膏方組主動脈HE染色圖（從左至右依次為×40，×100，×200，×400）

3.4 多元統計分析

3.4.1 QC樣本質控

經7-fold crossvalidation（7次循環交叉驗證）得到的PCA 模型圖，QC 樣本等量混合了所有被檢測樣本，圖中QC 樣本緊密聚集，表明此實驗過程中儀器檢測穩定性較好，重復性良好。見圖5。

圖5 所有樣本PCA得分圖

對QC 樣本的代謝物強度做Boxplot，以對其代謝物強度分布進行評估，其中Y 坐標為質譜強度log10 值，QC 樣本的代謝強度集中且穩定，表明本次實驗過程質譜系統穩定性較好，實驗結果可靠。見圖6。

圖6 樣本代謝物強度箱線圖

3.4.2 OPLS-DA分析

正交偏最小二乘方-判別分析（OPLS-DA）是有監督的判別分析統計方法。該方法在PLS-DA 的基礎上進行修正，濾除與分類信息無關的噪音，提高模型的解析能力和有效性，最大化凸顯模型內部不同組別之間的差異。在OPLS-DA 得分圖上，有兩種主成分，即預測主成分和正交主成分。預測主成分只有一個而正交主成分可以有多個。OPLS-DA 將組間差異最大化反映在t1 上，所以從t1 上能直接區分組間變異，而正交主成分上則反映了組內變異。另采用7 次循環交叉驗證（7-fold cross validation）和200 次響應排序檢驗（response permutation testing，RPT）的方法來考察模型的質量，用來衡量模型是否過擬合。

相關模型參數為R2X（cum）=0.657，R2Y（cum）=0.998，Q2=-0.307，模型質量好。結果組間區分明顯，即代謝物存在顯著差異，提示顆粒膏方對模型大鼠有一定治療作用。見圖7。

圖7 顆粒膏方組-模型對照組的OPLS-DA得分圖

相關模型參數為R2X（cum）=0.615，R2Y（cum）=0.979，Q2=-0.309，模型質量好。結果組間區分明顯，即代謝物存在顯著差異，提示傳統膏方對模型大鼠有一定治療作用。見圖8。

圖8 傳統膏方組-模型對照組的OPLS-DA得分圖

相關模型參數為R2X（cum）=0.49，R2Y（cum）=0.95，Q2=-0.035，R2Y 和Q2Y 直線的斜率比較接近水平直線，Q2 比較接近于零，因此該模型可能存在過擬合情況。因此雖然圖中顯示存在組間差異，但不排除模型過擬合導致誤差的可能。見圖9和圖10。

圖9 顆粒膏方組－傳統膏方組的OPLS-DA得分圖

圖10 顆粒膏方組－傳統膏方組200次響應排序檢驗

相關模型參數為R2X（cum）=0.637，R2Y（cum）=0.968，Q2=-0.187，模型質量好。結果組間區分明顯，即代謝物存在顯著差異，提示中藥湯劑對模型大鼠有治療作用。見圖11。

圖11 中藥湯劑組－模型對照組的OPLS－DA得分圖

3.5 差異代謝物篩選

采用多維分析和單維分析相結合的辦法，篩選組間差異代謝產物。差異代謝物篩選的標準為：OPLS-DA模型第一主成分的VIP值＞1，T檢驗的p-value值＜0.05。經篩選后組間差異代謝物數量見表3。

表3 各比較組差異代謝物數統計

3.5.1 組間差異代謝物詳表

組間VIP 值前20 的差異代謝物見表4～表7。其中FC 表示差異倍數，FC＞1 表示組間比較，差異物上調，FC＜1則表示下調。

表4 顆粒膏方組/模型對照組差異代謝物

表5 傳統膏方組/模型對照組差異代謝物

表6 顆粒膏方組/傳統膏方組差異代謝物

表7 中藥湯劑組/模型對照組差異代謝物

3.5.2 火山圖

圖12～圖15中紅色圓點代表在實驗組中顯著上調的差異代謝產物，藍色圓點代表顯著下調的差異代謝產物，灰色點代表不顯著的差異代謝產物。

圖12 顆粒膏方組-模型對照組的火山圖

圖13 傳統膏方組-模型對照組的火山圖

圖14 顆粒膏方組－傳統膏方組火山圖

圖15 中藥湯劑組－模型對照組的火山圖

3.6 代謝通路富集分析

通過對差異代謝物進行通路富集分析，有助于理解在差異樣品中代謝途徑變化機制。基于KEGG 數據庫對差異代謝物進行代謝通路富集分析。代謝通路中p-value 為該代謝通路富集的顯著性，選擇顯著性富集pathway 進行氣泡圖繪制。縱坐標為代謝通路名稱；橫坐標為富集因子（Rich factor，Rich factor=顯著差異代謝物個數/該pathway 中的總代謝物個數），Rich factor 越大，則說明富集程度越大；顏色由綠到紅表示p-value 依次降低；點越大，說明富集到該pathway 上的代謝物數目越多。

顆粒膏方組與模型對照組差異代謝物進行通路富集后，發現p-value＜0.05 的通路有16 條。分別為蛋白質消化吸收（Protein digestion and absorption），壞死性凋 亡（Necroptosis），β-丙氨酸代謝（beta-Alanine metabolism），癌癥的膽堿代謝（Choline metabolism in cancer），戊糖磷酸途徑（pentose-phosphate pathway），血小板活化（Platelet activation），逆行內源性大麻素信號（Retrograde endocannabinoid signaling），氨酰tRNA生物合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis），卵巢類固醇生成（Ovarian steroidogenesis），乙醛酸和二羧酸代謝（Glyoxylate and dicarboxylate metabolism），味覺傳導（Taste transduction），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（Alanine，aspartate and glutamate metabolism），亞油酸代謝（Linoleic acid metabolism），不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids），癌癥的中心碳代謝（Central carbon metabolism in cancer）和溶酶體（Lysosome）。見圖16和表8。

圖16 顆粒膏方組－模型對照組氣泡圖

表8 不同比較組之間富集通路統計列表

顆粒膏方組與模型對照組差異代謝物進行通路富集后，發現p-value＜0.05 的通路有8 條。分別為壞死性凋亡（Necroptosis），卵巢類固醇生成（Ovarian steroidogenesis），不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids），蛋白質消化吸收（Protein digestion and absorption），肌動蛋白細胞骨架的調節（Regulation of actin cytoskeleton），神經活性配體受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction），GnRH 信號通路（GnRH signaling pathway）和利什曼病（Leishmaniasis）。見圖17和表8。

圖17 傳統膏方組－模型對照組氣泡圖

顆粒膏方組與模型對照組差異代謝物進行通路富集后，發現有且僅有1 條通路，為嘌呤代謝（Purine metabolism）。見圖18和表8。

圖18 顆粒膏方組－傳統膏方組氣泡圖

中藥湯劑組與模型對照組差異代謝物進行通路富集后，發現p-value＜0.05 的通路有14 條。分別為組氨酸代謝（Histidine metabolism），味覺傳導（Taste transduction），ABC transporters，β-丙氨酸代謝（beta-Alanine metabolism），硫代謝（Sulfur metabolism），神經活性配體受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction），溶酶體（Lysosome），肌動蛋白細胞骨架的調節（Regulation of actin cytoskeleton），FoxO 信號通路（FoxO signaling pathway），氨酰tRNA 生物合成（AminoacyltRNA biosynthesis），甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism），NOD 樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway），尼古丁成癮（Nicotine addiction）和壞死性凋亡（Necroptosis）。見圖19和表8。

圖19 中藥湯劑組－模型對照組氣泡圖

4 討論

秦伯未先生治療胸痹心痛以“扶養心氣、和通血脈”為基本治則［7］，首屆國家級中醫藥教學名師袁肇凱教授宗其理念，調整組方而成的養心通脈方，對CHD心血瘀阻證、高脂血癥、高脂血癥伴胰島素抵抗均具有較好的療效，對于防治冠狀微循環障礙和微血栓形成，改善心肌供血，緩解心絞痛有確切作用。在機制學方面研究發現，養心通脈方具備改善心肌缺血、增加冠狀動脈血流量、促進血管再生等心肌修復功能［8］。本課題組前期開展的臨床研究顯示，養心通脈方對冠心病心絞痛緩解的總有效率為91.7%［9］。王東生等的實驗研究顯示，養心通脈片對動脈粥樣硬化模型大鼠具有顯著降脂作用［10］。

本研究中，根據心電圖以及主動脈HE 染色結果可知，養心通脈方顆粒膏方及傳統膏方對冠心病血瘀證模型大鼠均有治療作用，藥物干預后的大鼠心電圖及主動脈HE 染色切片結果均有好轉趨勢，兩種劑型的膏方均有顯著療效。經代謝組學分析發現，顆粒膏方組/模型對照組、傳統膏方組/模型對照組、中藥湯劑組/模型對照組組間差異物共同富集的通路是壞死性凋亡（Necroptosis）；顆粒膏方組/模型對照組、傳統膏方組/模型對照組共同富集的代謝通路有蛋白質消化吸收（Protein digestion and absorption），卵巢類固醇生成（Ovarian steroidogenesis），不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis of unsaturated fatty acids）；顆粒膏方組/模型對照組、中藥湯劑組/模型對照組共同富集的代謝通路有溶酶體（Lysosome），氨酰tRNA 生物合成（AminoacyltRNA biosynthesis），味覺傳導（Taste transduction）；傳統膏方組/模型對照組、中藥湯劑組/模型對照組共同富集的代謝通路有神經活性配體受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction），肌動蛋白細胞骨架的調節（Regulation of actin cytoskeleton）。

壞死性凋亡（Necroptosis）結合了壞死和凋亡的特征，受到一系列特有信號通路的密切調節。壞死性凋亡被認為是心臟疾病如血管粥樣硬化、缺血再灌注損傷、心肌梗死和心臟重構的重要病理、生理學組成部分［11］。有研究提出，心肌細胞死亡的調控形式在心肌梗死再灌注（缺血/再灌注）中起著重要作用［12］。由實驗結果可知，顆粒膏方、傳統膏方、中藥湯劑在發揮對冠心病血瘀證的治療作用中，均涉及了壞死性凋亡這一通路，針對壞死信號通路的干預可能為心血管疾病的治療提供有益幫助。目前已有大量研究發現許多中藥復方或提取物能通過調控線粒體、死亡受體或ERS凋亡途徑，或調節細胞凋亡途徑中的關鍵因子、通路或靶基因等，發揮顯著的心肌或血管保護作用［13］。該通路所含的差異代謝物之一：花生四烯酸，是一種不飽和脂肪酸，也是許多循環二十烷酸衍生物的生物活性物質，如前列腺素E2（PGE2）、前列腺環素（PGI2）、血栓烷素A2（TXA2）和白細胞三烯C4（LTC4）的直接前體。這些生物活性物質對脂質蛋白的代謝、血液流變學、血管彈性、白細胞功能和血小板激活等具有重要的調節作用，而以上生物環節與冠心病血瘀證的形成密切相關。HUANG 等的研究顯示，發生AMI 的患者中特定花生四烯酸代謝產物的基線水平明顯高于對照組［14］。魏星的研究亦發現花生四烯酸是冠心病血瘀證的潛在代謝標志物［15］。同時花生四烯酸還涉及卵巢類固醇生成、不飽和脂肪酸的生物合成兩條通路。KL、CT、E 三組的花生四烯酸水平均高于模型對照組，提示經藥物干預后，花生四烯酸的代謝水平下降，其含量上升并趨向正常組水平，一定程度上可延緩冠心病的進展。壞死性凋亡通路所涉及的另一差異代謝物是鞘磷脂，這是動物細胞膜及其他各種生物膜的主要組成部分。鞘磷脂的代謝產物如神經酰胺（ceramide，Cer）、鞘氨醇（sphingosine，Sph）、1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）是具有生物活性的信號分子，可參與細胞增殖與凋亡的調控，由Cer、Sph和S1P共同構成的動態體系，也被稱作“鞘磷脂變阻器”（Sphingoliiic Rhecostat）［16］。神經酰胺作為細胞第二信使，在心血管系統可以產生多樣的生物學效應：①誘導包括平滑肌及心肌細胞在內的各種細胞凋亡；②調節平滑肌細胞的分化和增殖；③調節免疫功能和炎癥反應；④參與氧化應激［17］。研究發現，鞘磷脂類信號通路參與缺血再灌注損傷［17］，極低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）等致動脈粥樣硬化的脂蛋白都富含鞘磷脂，動脈粥樣硬化病變中鞘磷脂的含量高于正常動脈組織，抑制鞘磷脂的從頭合成可明顯抑制動脈粥樣硬化形成［18］。還有證據表明，人體血漿鞘磷脂水平是冠狀動脈性心臟病的獨立危險因素［19-20］，而且可以預測急性冠狀動脈綜合征患者的預后［20］。本研究中，KL、CT、E三組的鞘磷脂水平均高于G組，與現有學說不符合，其深層原因需要進一步研究探討。

在其他的代謝通路中，涉及最多的是氨基酸類差異代謝物。鄭景輝等的研究顯示，冠心病血瘀證的代謝通路有氨酰tRNA 生物合成、丙酸代謝等［21］。本次研究發現了顆粒膏方和中藥湯劑可通過氨酰tRNA 生物合成通路發揮對冠心病血瘀證的治療作用。該通路涉及的差異代謝物有L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸和L-天冬酰胺。研究表明組氨酸可以作為冠心病血瘀證的潛在生物標志物［22-23］，異亮氨酸也是冠心病血瘀證的潛在代謝標志物［15］。TAO等通過臨床研究發現，冠心病經過藥物治療后，其血清的L-賴氨酸含量較治療前發生顯著變化［24］。還有研究發現在冠狀動脈發生之前會發生天冬酰胺穩態的改變［25］，對于冠心病有診斷意義。顆粒膏方組、中藥湯劑組較模型對照組L-組氨酸水平顯著下調，傳統膏方組、中藥湯劑組較模型對照組L-異亮氨酸下調，顆粒膏方組較模型對照組L-賴氨酸、L-天冬酰胺含量下調，顆粒膏方組、傳統膏方組較模型對照組丙酸水平顯著下調，提示養心通脈方可能通過調節相關氨基酸代謝含量水平而發揮治療效果。牛磺酸作為游離氨基酸中的一員，具有較強的抗氧化活性，能通過清除自由基，改善冠心病患者血管內皮的舒張功能，從而減少心肌受損，在冠心病患者中血液含量明顯低于正常人［26-27］。也有研究發現高水平的牛磺酸可能對冠心病患者具有保護作用［28］。中藥湯劑組牛磺酸含量高于模型對照組，表明養心通脈方可以調節機體牛磺酸含量以治療冠心病。目前許多研究表明，冠心病患者存在氨基酸代謝異常，本次實驗發現養心通脈方治療冠心病血瘀證涉及的差異氨基酸主要有L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-天冬酰胺、牛磺酸。

冠心病血瘀證形成過程還與心肌細胞能量代謝密切相關。乙酰膽堿（Ach）是一種神經遞質，由膽堿和乙酰輔酶A在膽堿乙酰移位酶（膽堿乙酰化酶）的催化作用下合成，與三大營養物質的氧化供能反應密切相關。本研究發現其涉及了神經活性配體受體相互作用、肌動蛋白細胞骨架的調節、味覺傳導三條通路。引起乙酰膽堿量子性釋放的關鍵因素是神經末梢去極化引起的Ca2+內流。當神經沖動傳至神經終板時，膜電位下降，導致可使Ca2+通過的電壓閘門通道開放，使Ca2+進入終板，從而刺激終板分泌乙酰膽堿。傳統膏方組、中藥湯劑組較模型對照組乙酰膽堿含量有下調趨勢，養心通脈方可能發揮了類鈣離子拮抗劑的作用，抑制了鈣離子內流過程，從而導致Ach含量下調。在動物細胞中Ach與受體結合后，一方面直接影響膜對離子的通透性，另一方面通過各種第二信使影響各種生理過程的進行。Ach 可引起許多血管擴張，如肺和冠狀血管；但如果血管內皮受損，則Ach的上述作用將不復存在，相反可引起血管收縮。冠心病血瘀證病理狀態下，其血管內皮處于損傷狀態，此時Ach的縮血管作用對機體不利，為提高冠脈血流量引起的Ach水平下降也可能是養心通脈方的作用機制之一。冠心病血瘀證與肌動蛋白基因及其代謝調控相關［29］，這也可能是Ach含量變化的原因之一。檸檬酸是檸檬酸循環的重要中間代謝物，而檸檬酸循環又是三大營養素（糖類、脂類、氨基酸）的最終代謝通路，也是三大營養素代謝聯系的樞紐，更與能量代謝密切相關。二磷酸腺苷（ADP）為三磷酸腺苷（ATP）水解失去一個磷酸根，即斷裂一個高能磷酸鍵，并釋放能量后的產物。ADP也存在于血小板細胞內的高密度顆粒內，當血小板發生凝聚反應時被釋放，ADP通過血小板上的ADP受體對血小板的形狀及生物學行為產生影響，進一步加速血小板的凝聚過程。它是人們發現最早、也是體內最重要的誘導血小板聚集的物質，在體外實驗中可觀察到其誘導的兩種血小板聚集類型。顆粒膏方組、中藥湯劑組較模型對照組ADP含量顯著上調，這可能是養心通脈方發揮了類ADP 受體拮抗劑的作用，阻止了被釋放的ADP與血小板受體結合而減弱血小板的凝聚過程，發揮了“抗血瘀”作用。也可能是冠心病血瘀證本身或者經藥物干預后，ATP與ADP轉化的平衡發生改變所致。也有研究顯示，心肌缺血模型與假手術組的心肌ADP含量無統計學意義，經針刺治療后其心肌ADP含量與心肌缺血模型組亦無統計學意義［30］。因此ADP含量變化的原因及機制需要進一步深入研究。

中藥膏方的應用歷史悠久，《黃帝內經》記載有“馬膏”“豕膏”。豕膏在當時既作外用亦供內服，而馬膏僅供外用。至東漢時期，內服膏劑以“煎”的形式出現，如《金匱要略》中記載有“大烏頭煎”［31］，即“大烏頭五枚，水三升，取一升，去渣，納蜜二升，煎令水氣盡，強人服七合，弱人服五合；豬膏發煎，膏、亂發，上二味，和膏煎之，發消藥成，分再服，并從小便出。”其制備方法與現代膏方的制備方法類似。膏方應用廣泛，中醫臨床應用涉及內、外、婦、兒以及治未病等。范春香等采用加味香砂六君膏方調治脾胃虛弱型慢性萎縮性胃炎，對52 例患者進行服藥后臨床觀察，發現總有效率達到88.46%［32］。周韶谷等采用補腎納氣平喘膏方治療兒童支氣管哮喘，將113 例患者隨機分為治療組（補腎納氣平喘膏方）和對照組（酮替芬），其治療總有效率分別為91.53%和77.78%［33］。代國方等的研究顯示，益氣活血中藥膏方在干預冠心病冠脈支架植入術后氣虛血瘀證患者再狹窄有較好作用［34］。膏方具有補虛和治病兩大特點，冠心病（胸痹心痛）中醫病機為本虛標實，其疾病特點決定了患者長期服藥的必要性。膏方服用方便、口感較好、一人一方的優點可以極大提高患者的服藥依從性，克服了傳統中藥煎煮繁瑣、入口苦澀等不便，符合現代人群的醫療需求。本次研究發現顆粒膏方、傳統膏方及中藥湯劑對冠心病血瘀證均有顯著的治療作用，但是代謝組學分析的通路顯示各組藥物干預后的具體代謝情況既有交叉的共性部分，也有各自不同的特異部分。相關的特異部分可能與膏方制作的配料以及制作工藝有一定關系，這些變量的影響需要進一步研究。

5 小結

養心通脈方的顆粒膏方、傳統膏方與中藥湯劑均有針對冠心病血瘀證的治療作用，其治療效果無顯著差異，其作用機制與壞死性凋亡、氨基酸代謝與能量代謝密切相關，且養心通脈方可能具有類鈣離子拮抗劑、類ADP受體拮抗劑的作用。