冷刺激磨牙對TRPM8基因敲除小鼠腦干中c-Fos表達的影響

艾 林,高 鵬,李 愷,張若冰

(1.空軍軍醫大學西京醫院口腔科，陜西 西安 710032;2.陜西省藥品監督管理局，陜西 西安710065)

牙髓又稱牙髓蛋白復合體，是人體內神經支配最密集的組織之一。牙髓中的感覺神經元對溫度、物理、化學刺激都有反應，反饋為疼痛[1]。牙髓神經元被各種炎癥介質激活，包括內源性物質，如緩激肽和神經生長因子(Nerve growth factor，NGF)，以及外源性物質，如辣椒素等[1-2]。人類感知溫度的能力很大程度上取決于瞬時受體電位(Transient receptor potential,TRP)離子的受體，TRP通道可以被溫度和某些化學物質激活，如辣椒素、薄荷腦、芥末油、樟腦和丁香酚等[3]。當這些化學物質被用于人體時，它們會引起燃燒或冰冷的感覺，激活背根神經節(Dorsal root ganglion,DRG)神經元和三叉神經節神經元中的受體，作為警告信號預防牙髓損傷。此外，炎癥介質如緩激肽、前列腺素E2也可以調節這些受體[4]。其中TRPM8受體是冷感覺的主要分子介質，體外研究確定TRPM8的組織分布僅限于成人DRG神經元和三叉神經節，尤其是小直徑C纖維神經元，激活范圍在19～25 ℃之間[5]。本研究選取基因c-Fos及其蛋白作為脊髓和腦干神經元對溫度反應的活性標志物，研究c-Fos在三叉神經核中的表達，確定冷刺激牙髓是否會增加野生型小鼠腦干中c-Fos的表達，觀測對傷害性刺激有反應的神經元群的精確解剖位置，以及冷刺激牙髓炎癥的小鼠磨牙對腦中c-Fos的表達影響，使用TRPM8基因敲除小鼠研究TRPM8是否介導牙髓冷刺激痛，為臨床緩解牙髓炎等疼痛癥狀提供理論保障。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 TRPM8雜合子小鼠由上海交通大學醫學院徐天樂教授惠贈。DMEM、DMEM/F-12、胰蛋白酶(Sigma公司，美國)；胎牛血清、膠原酶Ⅳ、DMSO(美國Hyclone公司)；Percoll分離液、TRIzol溶液、臺盼藍(Invitrogen公司，美國)；TRPM8羊抗鼠一抗(Santa Cruz公司，美國)；熒光定量RT-PCR試劑盒(深圳科潤達生物工程有限公司，中國)；BCA蛋白定量試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司，中國)。超凈工作臺(蘇州凈化設備廠，中國)；電子分析天平(賽多利斯公司，德國)；CO2培養箱(賽默飛世爾科技有限公司，中國)；熒光倒置顯微鏡、凝膠成像系統、顯微攝像全自動圖像分析儀(Olympus公司，日本)；核酸分析儀(Pharmercia公司，瑞典)；定量PCR儀，DNA測序儀(ABI公司，美國)；石蠟、冰凍組織切片機(Leica公司，德國)；酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 TRPM8基因敲除小鼠的繁殖與鑒定：選取TRPM8基因雜合子(TRPM8+/-)小鼠，按照無特異病原體(SPF)級動物飼養標準(26 ℃，相對濕度50%～70%，明暗交替12 h/d，)進行飼養繁殖。本實驗采用TRPM8+/-鼠進行繁殖，其子代小鼠可能出現TRPM8+/+、TRPM8+/-、TRPM8-/-的基因型，在小鼠斷乳后，剪取小鼠尾尖1.0～1.2 cm,參照試劑盒說明書進行小鼠基因型鑒定，分離出TRPM8-/-進行繁殖。

1.2.2 冷刺激牙髓：通過吸入異氟醚(與氯胺酮相比不會影響腦干神經元的放電)和腹腔注射2.5%三溴乙醇進行麻醉。使用內部飽和冰渣的棉花球在小鼠左上磨牙的頜面上直接涂抹，1次/2 min，在30 min內至少重復12次。以對側同名牙作為空白對照。使用手術顯微鏡觀察冷刺激對上頜磨牙的作用。根據需要對動物進行再麻醉，以確保它們在灌注前保持無意識。

1.2.3 組織制備：初始刺激結束2 h后，麻醉的小鼠經心灌流20 ml 0.1 mol/L PBS以及20 ml 4%多聚甲醛。灌注后，將腦干解剖取出制備以下標本。①冰凍切片用標本：置于4% PFA中固定48 h，之后轉入30%蔗糖PFA中脫水，待標本沉底后更換30%蔗糖PFA溶液；再次沉底脫水充分后，取出腦標本用濾紙吸取表面殘留液體，置于-80 ℃超低溫冰箱中長期保存備用。②石蠟切片用標本：小心剝離腦組織后置于4% PFA中固定48 h，之后轉入50%酒精中脫水30 min，后將腦組織置于70%酒精中室溫保存備用。③新鮮標本：小心剝離腦組織，于冰上分離小腦，置于EP管中保存于-80 ℃超低溫冰箱中，留待蛋白提取。

1.2.4 免疫組織化學：①石蠟標本制備及HE染色：將標本從70%酒精中取出，取下小腦，置于包埋框，依次將標本脫水、透明、浸蠟處理，按冠狀面垂直于底面包埋，4 ℃冰箱中過夜。取出蠟塊。用石蠟切片機切取厚度為5 μm小腦矢狀面切片，37 ℃恒溫箱中烘干，常溫保存。標本常規脫蠟及水化，過伊紅染色液，沖洗自然風干后，DPX封片，標本室溫保存，待拍照。②冰凍切片：從-80 ℃超低溫冰箱中取出標本，去除小腦，以嗅球朝上方向包埋固定，用冰凍切片機切取40 μm大腦冠狀面切片，0.01 mol/L PBS漂洗，置于防凍液中，-20 ℃冰箱中保存備用。③免疫組織化學熒光染色：選取合適位置的小鼠大腦切片，0.01 mol/L PBS中漂洗3次后分別置于3% H2O2、0.3% Triton以及3% BSA溶液中，浸泡后分別漂洗3次，并置于中在37 ℃恒溫箱中孵育30 min。將標本置于一抗中，4 ℃孵育過夜(c-Fos抗體孵育48 h)，0.01 mol/L PBS漂洗后置于二抗中，37 ℃恒溫箱中孵育2 h后用0.01 mol/L PBS漂洗3次。以AVP及GR指標做免疫熒光染色，再次二抗孵育后，漂洗、復染、封片，-20 ℃保存待拍照。再以c-Fos及Ibal做免疫組化染色，進行DAB顯色、漂洗、DPX封片，室溫保存待拍照。④免疫印跡試驗(Western blot)：裂解液裂解后提取小腦蛋白，吸取上清液，計算出小腦蛋白樣品的蛋白濃度。將蛋白樣品、緩沖液及裂解液混合配平煮沸變性后于-80 ℃冰箱中保存。SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，將蛋白進行分離、轉膜。取出膜，TBST緩沖液漂洗后于5%脫脂牛奶的搖床上室溫孵育3 h。再次使用TBST漂洗3次，將條帶加入一抗后4 ℃孵育過夜，漂洗3次后加入二抗后室溫孵育3 h。漂洗3次，每次10 min，Western曝光儀下進行曝光。⑤細胞計數：在10倍顯微鏡下觀察載玻片，由一名獨立的觀測者比較同側(刺激)和對側(非刺激)三叉神經核(尾狀、過渡區或間極)c-Fos免疫反應細胞的數量，以及細胞是否出現在灰質或白質。

1.3 觀察項目 選取小腦矢狀面中間部位形態相似切片進行免疫組化熒光染色及HE染色。蛋白印跡分析蛋白表達量為目的條帶灰度值與內參灰度值之比，其結果取平均值進行比較。比較各組小鼠同側和對側三叉神經核內c-Fos陽性細胞數的平均值。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行單因素方差分析，組間比較采取LSD-t法,P<0.05為具有統計學差異。

2 結 果

2.1 尾端核c-Fos表達的差異 同側和對側尾端核c-Fos表達比較差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

2.2 間極核c-Fos表達的差異 同側間極核(平均4.56個細胞/切片)和對側間極核(平均3.42個細胞/切片)c-Fos表達比較有統計學差異(P<0.05)(圖2)。

圖2 冷刺激對野生型小鼠間極核c-Fos表達的影響

2.3 尾端核和間極核之間過渡區c-Fos表達的差異 在位于尾端核和間極核之間的過渡區，同側(平均50個細胞/切片)的c-Fos表達顯著高于對側(平均18個細胞/切片)(P<0.05)(圖3)。免疫組織學切片顯示實驗側c-Fos表達更強(圖4)。

圖3 冷刺激對野生型小鼠尾端核和間極核過渡區c-Fos表達的影響

2.4 冷刺激對TRPM8基因敲除小鼠c-Fos表達的影響 冷刺激小鼠磨牙，顯示TRPM8基因敲除小鼠與野生型小鼠出現相似的c-Fos表達模式，冷刺激側c-Fos表達增加，但差異無統計學意義(P>0.05)(圖5)。

A：腦干免疫組織化學切片顯示c-Fos表達(×4);B：同側(實驗側)放大顯示穩定的c-Fos表達(×10);C：對側(對照側)放大顯示c-Fos細胞較少(×10)

野生型小鼠(WT)：在三個解剖位置，實驗側c-Fos表達增加;TRPM8基因敲除小鼠(TRPM8)：實驗側c-Fos表達同樣增加;野生型小鼠和TRPM8基因敲除小鼠在各個解剖位置上c-Fos表達比較無統計學差異

3 討 論

瞬時受體電位通道(Transient receptor potential channels，TRPs)是一種位于細胞膜上的陽離子通道，最早在果蠅的視覺系統中發現[6]。根據序列和結構的同源性目前已發現28種TRP通道亞型,分為6個亞家族,參與多種機體調節機制及疾病病理生理過程[7]。TRP通道可以接受信使分子、化學、物理及溫度等變化的調節，是細胞重要的感受器。TRP通道家族分布廣泛[4,8],主要功能包括：溫度和疼痛感覺、機械感覺、味覺感覺、介導PLC依賴的鈣內流、維持細胞離子穩態、參與細胞生長調控、調節神經遞質釋放和激素分泌等。Tsavaler等[9]用人類前列腺特異性互補DNA(cDNA)文庫的方法分離出了一種新型的前列腺特異性基因，命名TRPM8。人類TRPM8的基因位于染色體2q37.1部位,全長102.12 kb[10]。TRPM8主要分布于前列腺、背根神經節和三叉神經的感覺神經元，是一種非選擇性的陽離子通道，有研究表明TRPM8通道和冷覺感受器之間的溫度-反應性曲線有一定的波動性[11]。TRPM8有通道激活的溫度閾值，溫度閾值指溫度感覺神經元開始誘發動作電位的特定溫度，其溫度敏感性主要依賴于跨膜電壓。桉葉腦、芳樟醇、香葉醇也可以激活TRPM8產生涼爽的感覺[12]。因此TRPM8對于冷刺激的傳導起著重要作用。

牙髓中的感覺神經元對溫度、化學、機械刺激都有反應，就像在牙本質過敏癥的情況下一樣。此外，牙髓神經元也可以被各種炎癥介質激活。牙髓的傷害感受器可分為兩類：①A-δ(有髓)纖維位于牙髓周圍，刺激閾值相對較低，并產生劇烈的刺痛。這些纖維占支配牙髓、牙本質、前牙本質和牙髓角附近成牙本質細胞層的25%～50%。②C(無髓鞘)纖維位于牙髓深處。它們具有較高的刺激閾值，通常在組織損傷時被激活，并以隱痛為特征。刺激溫度分為無害低溫(15～30 ℃)，有害低溫(15 ℃及以下)和有害高溫(43 ℃以上)三種類型[2]。人類感知溫度的能力很大程度上取決于瞬時受體電位離子的受體。對牙髓的感覺刺激，無論是溫度、化學還是機械刺激，都反饋為疼痛。牙本質敏感性的流體動力學理論認為，刺激會引起牙本質液體流動的變化，從而通過機械感受器反應激活神經纖維，從而引起疼痛。然而，最近研究[4，13]發現的TRPs是溫度刺激激活神經末梢的另一種機制。

本研究選取的基因c-Fos及其蛋白作為脊髓和腦干神經元對有毒化學、熱和機械刺激的反應的活性標志物。通常基因表達是用原位雜交來測量的，而蛋白質的表達也可以用免疫細胞化學技術來評估。通過使用c-Fos，可以觀測到對傷害性刺激有反應的神經元群的精確解剖位置。通過計算參與刺激信號的中樞神經系統解剖區域中標記的神經元數量來量化蛋白表達。但將c-Fos表達量誘導到可靠測量的水平需要強烈而持久的刺激，而且并非所有的神經元在激活時都能表達這種基因。因此，c-Fos表達的缺失不能說明對應的神經活動的缺失。

本研究結果表明，冷刺激實驗小鼠正常牙髓后，過渡區神經元中c-Fos的表達顯著增加,這一發現表明，有害的冷刺激會增加相關腦干神經元的神經活動。本研究所建立的模型可用于研究牙髓疼痛的傳導，使用c-Fos表達也可以作為牙髓疼痛傳導測量的有效工具。如前所述，誘導c-Fos需要強烈而持久的刺激。盡管我們無法精確測量冷刺激作用于小鼠磨牙的量，但本研究表明，在有害的冷刺激時，c-Fos的表達顯著增加，這表明刺激的量和時間是足夠的。本研證明c-Fos在三叉神經核中的表達，確定冷刺激牙髓增加了野生型小鼠腦干中c-Fos的表達。

本研究顯示:TRPM8的缺失不會影響冷誘導c-Fos的表達，這一發現表明TRPM8可能不是小鼠牙髓中負責溫度傳遞的唯一受體，還應考慮其他冷傳導通道的作用，如鉀通道和鈉通道。有研究[14]證明人牙髓成纖維細胞和成牙本質細胞在分子、蛋白質和功能水平上表達TRPs，特別是TRPA1和TRPM8,結果表明成纖維細胞和成牙本質細胞也可能在調節人類牙齒的冷刺激反應中起作用，本研究為臨床緩解牙髓炎等疼痛癥狀提供理論支持。