膠質瘤中環狀RNA has-circ-0037251水平檢測及臨床意義

徐澤彪,胡珍淵,方永軍,王首杰

(1.陜西中醫藥大學附屬醫院神經外科,陜西 咸陽712000；2.空軍軍醫大學唐都醫院神經外科，陜西 西安710038)

膠質瘤具有復發率高、生存率低、侵襲性強的特點，是高度惡性的顱內腫瘤，多數患者治療效果不佳，嚴重威脅著人們的健康[1]。因其與正常腦組織無明顯界限，且呈指狀向腦組織外破壞腦組織，常規切除術療效不佳，且高度惡性的膠質瘤對放化療敏感性差，因此尋找新的治療靶點成為當前的研究熱點[2-3]。最近的研究表明，環狀RNA在神經組織中含量更加豐富，其在神經元的發育、增殖、腫瘤及其他疾病發生中扮演著重要的角色[4-5]。如在缺血性腦卒中模型中circDLGAP4作為miR-143的海綿，其表達水平的降低能抑制miR-143的功能，增加circDLGAP4的表達量可減輕腦損傷[6-8]；circZNF292通過調控細胞間Wnt信號，影響細胞的增殖，進而參與影響腫瘤組織的血管生成[9-10]；has-circ-0037251是由METRN基因的多個外顯子組成的環狀RNA，在膠質瘤細胞的增殖和分化中發揮重要的調節作用。此外，研究表明has-circ-0037251通過發揮miR-1229-3p海綿和調節mTOR的表達作用促進膠質瘤的進展，而敲除has-circ-0037251基因則能促進膠質瘤細胞凋亡，并誘導G1期阻滯[11]。目前，對于has-circ-0037251在不同級別膠質瘤中的表達水平還缺乏分析,尤其針對其在臨床診治中的意義還未得到充分研究。因此本研究結合臨床隨訪數據,主要探討has-circ-0037251在膠質瘤患者中的表達水平及與患者預后、臨床病理特征的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2011年7月至2014年12月于空軍軍醫大學唐都醫院神經外科行膠質瘤切除術的患者56例為膠質瘤組，其中男24例，女32例，中位年齡為51歲，以上腫瘤組織標本中WHO Ⅰ級20例，WHO Ⅱ級15例，WHO Ⅲ級8例，WHO Ⅳ級13例。標本來源于醫院日常收集的膠質瘤組織，患者的臨床病理數據是先前對患者的定期隨訪收集獲得。對照組腦組織取自腦出血或外傷需要接受開顱手術的患者，共30例，其中男15例，女15例，中位年齡為40歲。組織標本取出后即在液氮中冷凍，后轉入-80 ℃冰箱內。患者病例資料完整，術前均未進行放療、化療、手術，并且未進行靶向治療等其他新型治療手段。本研究經醫院倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》，研究對象或家屬均簽署了知情同意書。

1.2 檢測方法 將凍存的組織從-80 ℃冰箱取出，首先脫蠟處理腦組織標本，隨后加入TRIzol試劑從組織標本中提取RNA。采用紫外分光光度計測量RNA濃度，OD260/280在1.8～2.0之間為合格。使用RNA反轉錄試劑盒按照說明書操作，將提取的RNA逆轉錄為cDNA后進行熒光定量PCR 技術(qRT-PCR)反應，將GAPDH設為內參，其引物序列為上游5’- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’，下游5’- TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3’;人has-circ-0037251引物序列為：上游5’-CTGCTTTGGAGGTGATGGGGAC-3’,下游5’- GGGAGTCGGGGCTCTCAC -3’。采用2-△△Ct法計算has-circ-0037251的相對表達量。所有實驗重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0統計學軟件進行繪圖和統計學分析。兩組間患者臨床病理指標的比較采用卡方檢驗；生存率分析采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進行Log-Rank檢驗；采用單因素和多因素Cox回歸分析法評價影響患者預后的臨床因素，主要包括年齡、性別、KPS評分、WHO分級、腫瘤大小、腫瘤分化程度，評估has-circ-0037251表達量對患者預后差異的影響。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 膠質瘤組織中has-circ-0037251的表達水平 qRT-PCR結果表明：與對照組相比，膠質瘤組中的has-circ-0037251存在過表達現象[對照組(1.000±0.1756)與膠質瘤組織(3.913±0.2589),P<0.05]，且has-circ-0037251表達量與WHO分級呈正相關[WHO Ⅰ-Ⅱ級(2.429±0.1987)與WHO Ⅲ-Ⅳ級(4.628±0.3050)，P<0.05]，高水平表達has-circ-0037251的膠質瘤具有更高的WHO分級。見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05;與Ⅰ-Ⅱ級比較，△P<0.05

2.2 has-circ-0037251在膠質瘤組織中的表達與臨床病理特征的關系 計算膠質瘤患者has-circ-0037251表達水平的平均值，以此將膠質瘤患者分為has-circ-0037251高表達組(24例)和低表達組(32例)。通過對患者臨床病理特征的比較，發現has-circ-0037251的表達水平與WHO分級和KPS評分有關系(均P<0.05),而與年齡、性別、腫瘤大小等無關(均P>0.05)。見表1。

表1 has-circ-0037251表達水平與膠質瘤患者臨床病理特征的關系(例)

2.3 生存分析 隨訪期間，記錄患者生存情況。然后根據Kaplan-Meier法分析has-circ-0037251表達水平與患者預后的關系，發現has-circ-0037251低表達的患者生存時間更長，且差異具有統計學意義(P=0.0396)。因此，has-circ-0037251的表達量可作為判斷膠質瘤患者預后的生物學標志。見圖2。

圖2 高has-circ-00372517表達組和低has-circ-0037251表達組生存率比較

2.4 膠質瘤患者預后單因素和多因素分析 采用比例風險回歸模型進行單因素和多因素分析，結果表明：WHO分級、KPS評分、has-circ-0037251表達水平與患者總生存率相關，且高WHO分級、KPS評分<80、has-circ-0037251的高表達量是影響患者預后的獨立危險因素。見表2。

表2 患者臨床病理特征和has-circ-0037251表達的單因素和多因素分析表

3 討 論

膠質瘤是中樞神經系統原發的高度惡性的腫瘤，其增殖、侵襲、轉移能力強，造成患者預后不良，術后極易復發[12-13]。近年來對膠質瘤的研究不斷深入，但關于其基因調控、發生發展、增殖、侵襲、轉移等復雜的分子機制尚未完全闡明，如何改善患者預后，尋求理想的特異性腫瘤標志物對膠質瘤的診療有重要意義。

越來越多的的研究表明環狀RNA與神經系統的腫瘤的發生有密切聯系，諸多文獻報道環狀RNA參與了膠質瘤的發生和惡性發展過程[14]。circ-0001730參與激活wnt/β-catenin通路，促進膠質母細胞瘤的增殖，侵襲和遷移[15]。Li等[16]發現在膠質瘤中has-circ-0007534通過發揮miR-761海綿的作用，調節ZIC5基因的表達，提示has-circ-0007534/miR-761/ZIC5調控環有望成為新的治療靶點。此外,表皮生長因子受體(EGFR)來源的has-circ-0080229可通過結合ANXA2等RNA結合蛋白，促進膠質瘤的侵襲和轉移[17]。然而到目前為止，有關膠質瘤與環狀RNA的研究還不足以應用于臨床，此領域有待我們進行更深層次的探索。

本研究選取了與膠質瘤相關的一種環狀RNA——has-circ-0037251，探究其在膠質瘤的診療、預后判斷方面的作用。研究發現，與正常腦組織相比，膠質瘤患者的has-circ-0037251表達水平顯著上調，在探究has-circ-0037251表達水平與患者臨床病理指標相關性時發現，WHO分期、KPS評分與has-circ-0037251的表達顯著相關，這提示has-circ-0037251可能與膠質瘤的生長、侵襲和轉移有關，抑制has-circ-0037251表達有逆轉膠質瘤的進展的可能，這一點在小鼠體內已得到證實。Cao等[11]研究發現敲除has-circ-0037251可使腫瘤體積變小、重量減輕，延長小鼠生存期。然而，更有效、更準確、更特異的RNA干擾方法，尤其是能安全作用于人體的方案仍有待探索和研究。Kaplan-Meier法生存率分析表明，has-circ-0037251高表達組的生存時間低于低表達組，最后對患者的預后分析顯示WHO分級、KPS評分、has-circ-0037251表達水平是影響患者生存率的主要因素，而高WHO分級、KPS評分<80、has-circ-0037251高表達可作為膠質瘤患者的預后獨立因素。本研究結果為膠質瘤早期診斷、治療和及早干預提供了參考依據。

綜上所述，has-circ-0037251很有希望作為膠質瘤診斷和預后的生物學標志物，另外，has-circ-0037251能否在其他病理過程中起作用，能否尋找到一種有效干預RNA的手段以及has-circ-0037251能否人體內作為治療靶點都有待于進一步的深入研究。