自噬基因Beclin1在卵巢癌SKOV3細胞中對PI3K/AKT信號通路的影響及其與紫杉醇耐藥關系實驗研究

蘇 游，劉新月，劉巧梅

(廣西國際壯醫醫院婦科,廣西 南寧530201)

卵巢癌是臨床上一種較為常見的婦科腫瘤疾病，相關統計顯示，全球卵巢癌發病率居婦科惡性腫瘤第三位，且每年病死人數高達十多萬，病死率持續上升[1]。超過90%的患者確診時已處于卵巢癌Ⅲ-Ⅳ期，此時臨床治療多以手術切除和放化療為主。紫杉醇作為一線化療藥物在卵巢癌治療中應用廣泛，然而大部分患者病情復發會對紫杉醇產生耐藥，導致療效不佳，嚴重危險患者生存[2-3]。因此，逆轉紫杉醇耐藥，深入探討卵巢癌的調控機制，對靶向治療具有重要意義。自噬基因Beclin1屬于肌動蛋白類Bcl-2相關蛋白，位于人染色體17q21[4-5]。Beclin1基因在自噬活性及相關信號通路中，參與調控了多種腫瘤發生發展過程，其過表達可誘導細胞自噬、凋亡，抑制腫瘤的增殖、侵襲和遷移[5]。有研究[6-7]證實，Beclin1可與相關分子形成不同螯合物，包括Beclin1-UVRAG-PI3K、Beclin1-UVRAG-Rubicon-PI3K、Beclin1-Atg14-PI3K，說明Beclin1基因介導的腫瘤細胞自噬與EGFR/PI3K/AKT信號通路密切相關。因此，本文將探究自噬基因Beclin1過表達在卵巢癌SKOV3細胞中對PI3K/AKT信號通路的影響，并分析其與紫杉醇耐藥的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人卵巢癌紫杉醇耐藥細胞株SKOV3/TXA購自中科院上海細胞庫。細胞于含10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養基中(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)完全培養，并在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱條件下培養。胎牛血清、RPMI 1640培養基均購自Gibco公司。

1.2 細胞轉染及分組 取SKOV3/TXA(5×105)接種于6孔培養板，待細胞生長覆蓋孔底板面積的80%時，根據說明書操作步驟，通過Lipofectamine 2000(美國，Invivogen)將pcDNA3.1-Beclin1及pcDNA3.1轉染至SKOV3/TXA細胞中，轉染24 h 后將細胞轉移至RPMI 1640 培養基中繼續培養48 h，獲得穩定表達的細胞株。構建Beclin1基因表達載體pcDNA3.1/Beclin1。轉染pcDNA3.1-Beclin1和pcDNA3.1后的細胞分別作為Beclin1-SKOV3/TXA組和pcDNA3.1-SKOV3/TXA組。同時，未轉染的SKOV3/TXA細胞作為空白對照組。

1.3 MTT檢測Beclin1過表達對SKOV3/TXA細胞增殖的影響 實驗所用MTT試劑盒、0.25% 胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)等試劑均購自北京碧云天生物有限公司。收集各組對數生長期SKOV3/TXA細胞，調整細胞個數為1×105個/ml，接種于96孔板中(每個樣品設置5個復孔)，在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24、48、72 h。然后，應用MTT細胞增殖試劑盒測定1～3 d的增殖情況，具體步驟如下：每個孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h后停止培養，取上清液溶于150 μl二甲基亞砜(震蕩5～10 min)，采用酶標儀測定(490 nm處)光密度(OD)值，以時間為橫坐標、OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡及自噬情況 培養72 h后收集細胞，經PBS洗滌后，用70%乙醇固定。待細胞在PBS中懸浮30 min后，室溫下再加入 RNase A處理30 min。然后，將加碘化丙錠(PI)加入細胞液中，終濃度為20 mg/L。避光染色30 min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。同時，根據文獻報道方法，采用Monodansylcadaverine (MDC)標記自噬囊泡：細胞接種于6孔板中，加入0.05 mmol/L MDC(Sigma,St.Louis,MO)；然后，37 ℃溫育1 h，加入4%多聚甲醛進行固定(15 min)；PBS 洗3次，采用熒光顯微鏡觀察 MDC 標記的自噬囊泡。MDC標記染色后，再經胰酶消化制備單細胞懸液，再用4% 多聚甲醛固定，流式細胞儀測定熒光強度。

1.5 RT-PCR檢測細胞Beclin1 mRNA水平 根據文獻報道進行RT-PCR測定，利用Trizol(Trizol試劑盒購買于北京碧云天生物技術研究所)提取細胞總RNA，檢測RNA濃度及純度后，采用cDNA Kit試劑盒進行逆轉錄獲得cDNA。以GAPDH為內參，進行RT-PCR(設備Light Cycler@480，Roche公司)測定Beclin1 mRNA水平，引物由大連寶生物工程有限公司提供，序列見表1。反應條件如下：94 ℃變性2 min，94 ℃ 20 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s；循環45次。采用2-ΔΔCT計算mRNA相對表達量。

1.6 免疫印跡法(Western blot)檢測各組細胞Beclin1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達 取各組細胞用PBS沖洗，加入含蛋白酶和堿性磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液。4 ℃孵育30 min，收集細胞裂解液，10000 r/min離心10 min取上清。采用BCA試劑盒(北京碧云天公司)測定上清液蛋白含量后定量處理后，加入5×上樣染料沸水浴10 min。取15 μl樣品上樣進行10%SDS-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-聚丙烯酰胺試劑盒，北京碧云天公司)跑膠分離蛋白，電濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。再分別加入TBST稀釋的Beclin1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GAPDH抗體(美國Abcam公司)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3～5次后，加入HRP 標記的二抗室溫孵育，TBST洗膜ECL化學發光顯影，獲得條帶分析蛋白含量。

1.7 流式細胞儀檢測Beclin1過表達后紫杉醇對SKOV3/TXA細胞凋亡的影響 SKOV3/TXA細胞根據1.2分組后培養24 h。加入不同質量濃度的紫杉醇(0、500、1000、1500、2000及2500 ng/ml)預處理；于6孔板中培養72 h后 采用胰酶消化收集細胞，PBS洗滌。然后，參照1.4步驟采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結 果

2.1 各組SKOV3/TXA細胞Beclin1表達量比較 RT-PCR檢測結果顯示，pcDNA3.1-Beclin1SKOV3/TXA細胞中Beclin1 mRNA相對表達量顯著高于pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組(均P<0.05，圖1A)，說明pcDNA3.1-Beclin1轉染成功，Beclin1過表達。同時，Western blot檢測發現，Beclin1-SKOV3/TXA組Beclin1蛋白表達量也顯著高于pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組，差異有統計學意義(均P<0.05，圖1B)。

注：與SKOV3/TXA組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-SKOV3/TXA組比較，#P<0.05

2.2 Beclin1過表達對SKOV3/TXA細胞增殖及凋亡影響 培養24、48、72 h后，各組細胞OD值隨時間延長也明顯上升。轉染pcDNA3.1-Beclin后，Beclin1-SKOV3/TXA組細胞增殖能力較pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組均顯著降低(均P<0.05)；且凋亡率也明顯升高(均P<0.05)，見表2(圖2)。

表2 Beclin1過表達對SKOV3/TXA細胞增殖及凋亡影響

注：與SKOV3/TXA組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-SKOV3/TXA組比較，#P<0.05

2.3 Beclin1過表達對SKOV3/TXA細胞增殖及凋亡影響 流式檢測結果(圖3)，Beclin1-SKOV3/TXA組MDC 標記的自噬囊泡平均熒光強度為(2.36±0.67)，pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組MDC 標記的自噬囊泡平均熒光強度分別為(0.95±0.15)和(1.01±0.23)，提示Beclin1過表達可誘導SKOV3/TXA細胞自噬增加。

2.4 Beclin1過表達對PI3K/AKT信號通路的影響 Western blot測定各蛋白結果(圖4)，Beclin1-SKOV3/TXA組細胞p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT蛋白水平相對比值顯著低于pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組(均P<0.05)，其結果表明磷酸化水平降低。

注：與SKOV3/TXA組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-SKOV3/TXA組比較，#P<0.05

注：與SKOV3/TXA組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-SKOV3/TXA組比較，#P<0.05

2.5 Beclin1過表達對SKOV3/TXA細胞紫杉醇耐藥的影響 不同濃度紫杉醇作用下，Beclin1-SKOV3/TXA組細胞凋亡率均高于pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組，其中紫杉醇濃度為2000～2500 ng/ml，凋亡率差異均有統計學意義(均P<0.05)(圖5)。

注：與SKOV3/TXA組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-SKOV3/TXA組比較，#P<0.05

3 討 論

卵巢癌是婦科癌癥中常見的腫瘤惡性程度最高的疾病，早期病情隱匿，無特殊臨床癥狀，大數患者確診時已發現轉移，處于癌晚期，5年生存率不超過30%。紫杉醇作為腫瘤化療的一線藥物，在卵巢癌臨床治療中應用較為廣泛，然而長期使用易產生耐藥現象[2-3,8]。因此，探究卵巢癌紫杉醇耐藥機制，提高紫杉醇化療療效具有重要意義。

自噬基因Beclin1作為肌動蛋白類Bcl-2相關蛋白，可與Bcl-XL結合啟動細胞凋亡及自噬過程。鄧琦程等[5]報道，隨著卵巢癌分期的增加，腫瘤組織中Beclin1表達下調，細胞增殖、侵襲及轉移與自噬活性的降低明顯相關。因此，本研究通過在SKOV3/TXA中轉染pcDNA3.1/Beclin1構建Beclin1過表達模型。RT-PCR和Weatern-blot結果顯示，Beclin1-SKOV3/TXA組細胞中Beclin1 mRNA和蛋白表達量明顯升高，證實轉染成功，為后續實驗奠定了基礎。MTT實驗結果證實，Beclin1過表達后，SKOV3/TXA細胞株的增殖過程受到抑制，這是因為Beclin1刺激了自噬的發生，與Liang等[9]的報道一致。段振玲等[6]研究指出，Beclin1缺失與自噬囊泡的形成密切相關，Beclin1過表達可誘導細胞器產生大量的自噬囊泡，激活自噬溶酶體發揮自噬作用。本文采用MDC標記染色發現，Beclin1-SKOV3/TXA組細胞MDC 標記的自噬囊泡平均熒光強度顯著高于pcDNA3.1-SKOV3/TXA組和SKOV3/TXA組，證實Beclin1表達上調促進了自噬囊泡的形成，自噬溶酶體激活后增加細胞的自噬，細胞凋亡也隨之增加。

文獻報道[10-13]， PI3K/AKT信號通路在乳腺癌、結腸癌、宮頸癌、卵巢癌等腫瘤疾病中發揮了重要作用。磷脂酰肌醇-3激酶 (Phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K) 磷酸化后可激活其下游的AKT，AKT活化后可促進凋亡、自噬過程的啟動。劉川等[7]提出，卵巢癌的自噬過程除了Beclin1直接啟動自噬外，還與PI3K/AKt信號通路有關。為了進一步了解Beclin1對SKOV3/TXA自噬及凋亡影響的可能機制，本文采用免疫印跡Western blot檢測了各組p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白水平。結果發現，Beclin1過表達可顯著下調p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT的磷酸化,這提示Beclin1在卵巢癌中除了直接啟動自噬過程外，還有可能通過間接環節抑制PI3K/AKT信號通路而發揮自噬和促凋亡作用，具體中間環節還需后續開展整體動物實驗，從分子水平、基因水平進一步驗證。

誘導卵巢癌細胞凋亡是紫杉醇等化療藥物發揮殺傷作用的重要機制之一。有研究團在體外實驗中干擾相關基因的表達，在一定程度上可逆轉卵巢癌細胞對化療藥物的耐藥性[14-16]。因次，本文還考察了Beclin1過表達對SKOV3/TXA細胞紫杉醇耐藥的影響。采用0、500、1000、1500、2000、2500 ng/ml的紫杉醇預處理各組SKOV3/TXA細胞后，Beclin1-SKOV3/TXA組細胞凋亡率最高；且隨著紫杉醇濃度的升高，凋亡率也逐漸增加。凋亡率可以反映細胞對紫杉醇的敏感性和耐藥性，細胞凋亡率越高則表明敏感性越好，耐藥性越低。當紫杉醇濃度為2000、2500 ng/ml時，Beclin1-SKOV3/TXA組凋亡率顯著高于其他兩組，提示Beclin1過表達可提高SKOV3/TXA細胞株對一定濃度紫杉醇的敏感性，發揮促凋亡作用。

綜上所述，自噬基因 Beclin1 過表達可抑制卵巢癌細胞的增殖、促進細胞凋亡和自噬過程，從而逆轉SKOV3/TXA細胞的紫杉醇耐藥性，其機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路，誘導下游凋亡蛋白表達上調發揮凋亡作用，這為臨床治療提供了新方向。