葉面肥對油茶幼苗生長和生理特征影響的研究*

黃國文,張衛軍,鄧勝國

(湖南科技學院 化學與生物工程學院,湖南 永州 425199)

油茶(Camelliaoleifera)是山茶科(Theacae)山茶屬(Camellia)中重要的木本油料樹種，主要分布在湖南、廣西、四川、福建等18省區[1]，其種子榨取的茶油含有豐富的油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸，并含有生理活性強的甾醇、生育酚和角鯊烯，對于降低膽固醇、預防和治療人類常見冠心病和高血壓等心腦血管疾病有重要作用；此外，茶油可以深加工成高級天然護膚品，茶子餅富含茶皂苷、多酚、多糖等生物活性物質[2]，因此綜合開發油茶可以提高油茶的經濟價值和社會效益。葉面肥可以迅速補充植物生長發育所需要的營養成分，也可以彌充根部吸收肥料能力的不足，有利于培養出生長健壯的植株。葉面肥應用于油茶苗木施肥的技術得到了廣泛的研究，如：使用尿素和磷酸二氫鉀作為葉面肥來促進油茶幼苗和幼樹生長[3]；以磷酸二氫鉀、尿素、赤霉素、硼肥作為葉面肥來促進湘林1號油茶的6 a生嫁接植株的枝條和有效芽生長[4]；以硝酸鈉、硫酸鎂、硫酸鋅、鉬酸銨等作為葉面肥來提高4 a生和40 a生油茶的結實能力[5]；以標植營養液、植標植物營養液、果樹專用植物營養液、農藥、植物生長調節劑等作為配方施肥可以促進油茶苗木生長、染病植株復壯和提高座果率[6-8]等。1 a生油茶苗出圃時植株主根被短切并且須根少導致成活力不強，莖稈柔弱易倒伏，栽培時可以噴施葉面肥來促進幼苗生長。南方紅壤土由于長期的經受雨水的淋溶作用和土壤酸化作用，導致土壤中的氮、磷、鉀等嚴重不足，硼、鉬和有效鋅等元素嚴重缺乏。雖然對油茶幼苗噴施磷酸二氫鉀、尿素和氯化鉀的葉面肥可以促進油茶苗的生長，但是施肥以后油茶苗存在一定的落葉現象。目前認為，硼是細胞壁半纖維素的組成部分；鋅是色氨酸合成酶的輔酶，參與生長素的合成，蘋果(Maluspumila)缺鋅得小葉病；鉬是硝酸還原酶的輔酶，參與氮代謝，說明鉬鋅硼可能參與植株葉片的生長。因此,本文在磷酸二氫鉀、尿素和氯化鉀3種肥料配比優化的基礎上，對硼酸、硫酸鋅和鉬酸鈉進行三因素三水平的正交實驗設計來組合葉面肥，研究這些葉面肥對栽培的1 a生油茶出圃苗生長的影響，旨在培養出生長健壯的油茶栽培植株，為其豐產栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于湖南科技學院油茶實驗基地(111.84°E，26.58°N)，屬于中亞熱帶大陸性季風濕潤氣候。全年四季比較分明，平均氣溫為17.6～18.6 ℃，無霜期286～311 d，日最低氣溫0 ℃以下的天數只有8～15 d。多年平均降雪日數為3～7 d，極端最低氣溫在-4.9～-8.4 ℃之間。年平均降水量1 200～1 900 mm。栽培土為強酸性紅壤，養分含量低，適耕性差[9]。

1.2 試驗材料

以1 a生湘林210號油茶苗為研究對象，在2019年3月15日從苗圃的營養缽中移栽到含有紅壤土的培養盆中室外種植，待其生長30 d后進行施肥實驗。硼酸(H3BO3)、硫酸鋅(ZnSO4)、鉬酸鈉(Na2MoO4)均為國藥集團化學試劑有限公司生產的分析純試劑(純度≥99.5%)。

1.3 試驗設計

以優化的0.1%氯化鉀、0.2%磷酸二氫鉀和0.3%尿素為母液(此研究在2018年上半年完成，資料未發表)，以硼酸、硫酸鋅和鉬酸鈉等3種肥料進行L9(34)的正交試驗設計配比葉面肥，共有9種配比方法(表1)。這3種微量元素肥料的施肥預備試驗在2018年下半年進行并初步確定了3種無機鹽的較優水平(資料未發表)。在2019年4月中旬—7月中旬，對9種葉面肥噴施組、水平優化組和對照組(噴施水分)進行施肥試驗，每種葉面肥噴施10株，水分噴施10株，共110株，分成11組，每組每株分別掛牌編號，以防止混淆。用噴霧器將肥料噴施到每一株材料的每一個葉片背面，每隔8 d在晴天傍晚噴施1次，共噴施11次。

表1 L9(34)正交試驗中3種肥料的配比方法Tab.1 The ratio method of three kinds of fertilizer arranged by L9(34)orthogonal table

1.4 驗證試驗

以對油茶生長影響較好的優水平硼酸(第2水平)、硫酸鋅(第2水平)和鉬酸鈉(第1水平)以及已經優化的尿素、磷酸二氫鉀和氯化鉀的肥料組合成優化的葉面肥，并以水作為對照噴施油茶幼苗，研究了優化的葉面肥對油茶生長發育的影響。

1.5 試驗指標

在最后一次施肥后的第3 d測定每個處理的葉片的葉綠素、可溶性總糖、可溶性蛋白和多酚的含量,在第8 d測定多酚氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性，第15 d測定葉片的結構，并記數每個植株的葉片數和芽數目。

采用比色法測定葉片中葉綠素含量[11]。采用沸水提取和蒽酮比色法測定葉片中可溶性總糖的含量，采用0.02 mol/L磷酸緩沖液提取葉片中可溶性蛋白質并以雙縮脲法測定蛋白質的含量[11]。采用60%乙醇在60 ℃水浴鍋中浸提材料60 min來提取多酚，以酒石酸亞鐵比色法來測定多酚含量[12]。取處理的植株葉片，用比色法測定過氧化氫酶的活性、滴定法測定過氧化物酶活性、氮藍四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶活性、多酚氧化酶活性[13]。取每個處理的植株主干上部倒數第3片葉、下部順數第3片葉和中間部分的葉片，在離葉柄2 cm和離主葉脈左右1 cm區間做徒手橫切片，在顯微鏡下用目鏡測微尺測定葉片厚度、柵欄組織、海綿組織、上表皮和下表皮的厚度。

1.6 數據處理與分析

用Exce1軟件統計各種數據并進行極差分析，用SPSS 19軟件進行方差分析并用Duncan法進行差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 不同葉面肥對油茶幼苗葉片數和芽數的影響

葉片是植物的一種營養器官，能夠利用空氣中二氧化碳和水制造糖類物質，也能夠吸收葉片表面的無機鹽溶液來調節物質代謝，制造葉片和芽(頂芽和葉芽)生長所需要的的營養物質。植物的葉片和芽的數量能夠反映出植物的代謝強度和受到無機鹽的影響強度。針對9種混合肥料噴施的油茶植株統計3株的葉片數目和芽數目并進行極差分析和方差分析，計算葉片數目和芽數目的比值(表2)。結果表明，3種無機鹽能夠調節油茶葉片數目和芽數目的生長，影響油茶葉片數目多少和葉芽比大小的順序都為鉬酸鈉、硼酸、硫酸鋅，影響油茶芽數目的順序為硼酸、硫酸鋅、鉬酸鈉。3種無機鹽溶液中鉬酸鈉以第1水平的作用有利于促進葉片和葉芽比的增長，硫酸鋅以第2水平的作用有利于促進葉片數和芽數量的增長，硼酸以第2水平的作用有利于促進葉片數目的增加和葉芽比的提高。

表2 3種無機鹽對油茶幼苗的葉片數、芽數和葉芽比值的影響Tab.2 Effects of three inorganic salts on the number of leaves and buds and the ratio of leaves to buds of C.oleifera

2.2 不同葉面肥對油茶幼苗葉片結構的影響

植物感受葉面肥作用的最敏感器官是葉片，受葉面肥影響，葉片形態結構會發生變化。9種肥料噴施的植株葉片進行顯微切片觀察結果表明(表3～表4 )，3種肥料對油茶幼苗的上部葉、中部葉和下部葉的葉片厚度的影響表現出一致性，其強弱順序為硼酸、硫酸鋅、鉬酸鈉。油茶的上部葉、中部葉和下部葉的柵欄組織和海綿組織的厚度比值也呈現出一致性變化，都是柵欄組織多于海綿組織，3種肥料的影響順序為硫酸鋅、鉬酸鈉、硼酸。硼酸以第1水平和第3水平的作用有利于增加葉片的厚度，以第2水平的作用有利于增加柵欄組織與海綿組織的比值；硫酸鋅以第2水平的作用有利于增加葉片厚度以及柵欄組織與海綿組織的的比值；鉬酸鈉以第1水平和第2水平的作用有利于增加葉片的厚度，以第1水平的作用有利于增加柵欄組織與海綿組織的比值。油茶葉片的上表皮和下表皮的厚度比值(表5)，都是上表皮厚度大于下表皮的厚度，以鉬酸鈉的影響最大，其次是硼酸，以硫酸鋅的影響最小。上表皮和下表皮的厚度比值與柵欄組織與海綿組織的厚度比值并沒有表現一致的變化規律。

表3 3種無機鹽對油茶幼苗葉片厚度的影響Tab.3 Effects of three inorganic salts on the leaf thickness of C.oleifera

表4 3種無機鹽對油茶幼苗葉片柵欄組織厚度與海綿組織厚度比的影響Tab.4 Effects of three inorganic salts on the ratio of the thickness of palisade tissue and sponge tissue of C.oleifera leaves

表5 3種無機鹽對油茶幼苗葉片上表皮厚度與下表皮厚度的比值影響Tab.5 Effects of three inorganic salts on the ratio of the thickness of upper epidermis to that of lower epidermis of C.oleifera leaves

2.3 葉面肥對油茶幼苗葉綠素、可溶性總糖、蛋白質和多酚含量的影響

葉綠素是葉片吸收太陽光能和轉換成電能的基礎,葉綠素含量與光合作用強度密切相關。糖類是植物光合作用的直接產物，可溶性總糖是植物生長發育中需要的碳素營養的來源之一，也是植物生長發育和基因表達的重要調節因子；葡萄糖含量的標準曲線為y=0.101 1x，R2=0.998。植物中的可溶性蛋白質是氮素代謝的重要產物之一，是植物生命活動的執行者，植物蛋白質含量可以反映植物的氮素代謝程度；蛋白質含量的標準曲線為y=0.228 2x-0.000 8，R2=0.998。多酚是植物中含有酚性羥基的化合物的總稱，是植物對多糖、蛋白質、脂肪等初生代謝產物進一步代謝的次生代謝產物，多酚含量可以反映植物的次生代謝強度；茶多酚含量的標準曲線為y=0.037 3x，R2=0.997。9種葉面肥處理的油茶幼苗葉片葉綠素、可溶性糖、蛋白質和多酚的含量測定結果(表6)表明，3種無機鹽影響油茶葉片的可溶性總糖含量由強到弱的順序為硼酸、鉬酸鈉、硫酸鋅，其中硼酸、硫酸鋅和鉬酸鈉的第1水平作用下糖的含量較高。對葉片蛋白質含量的影響順序是硼酸、鉬酸鈉、硫酸鋅，其中硼酸第2水平、硫酸鋅第3水平和鉬酸鈉第1水平影響較大。對油茶葉片的葉綠素含量影響強弱順序雖然是硼酸、硫酸鋅、鉬酸鈉，但是極差太小和各水平間的差異不明顯，說明這3種無機鹽對葉片中葉綠素含量的影響較小。對油茶葉片多酚含量的影響順序為硼酸或鉬酸鈉、硫酸鋅，說明這3種無機鹽對多酚代謝調節的機理不同。

表6 3種無機鹽對油茶葉片葉綠素、可溶性總糖、蛋白質和多酚含量影響Tab.6 Effects of three inorganic salts on the content of chlorophyll,total soluble sugar,protein,polyphenol in C.oleifera leaves

2.4 不同葉面肥對油茶葉片氧化酶活性的影響

在逆境條件下，植物體內產生大量的活性氧自由基，會破壞細胞膜系統的結構，并使核酸突變，嚴重破壞細胞的結構和功能。植物體內的氧化酶(PPO、POD、SOD、CAT等)活性增強，能夠清除活性氧物質，以促進植物的正常生長發育。9種葉面肥噴施油茶后，葉片內的多酚氧化酶(PPO)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)等4種氧化酶活性測定結果(表7)顯示，3種無機鹽調節油茶葉片的PPO酶活性和CAT酶活性強弱的順序是一致的，其順序是硫酸鋅、鉬酸鈉、硼酸；而調節葉片中POD酶活性和SOD酶活性不同，硫酸鋅可以調節POD酶的最大活性，硼酸可以調節SOD酶的最高活性。3種無機鹽對油茶葉片中4種保護酶活性有不同的調節途徑，這些酶在葉片細胞內共同作用以維護油茶植株的正常生長發育。根據3種無機鹽作用于這4種酶均值的大小，硼酸以第1水平和第2水平的作用時PPO、CAT和SOD活性較高，以2和3水平作用時POD活性較高；硫酸鋅以1和3水平作用時PPO、POD和SOD活性較高，以2和3水平作用時CAT活性較高；鉬酸鈉以1和2水平作用時POD和SOD活性較高。

表7 3種無機鹽對油茶幼苗葉片4種氧化酶活性的影響Tab.7 Effects of three inorganic salts on the activities of four oxidases from leaves of C.oleifera seedlings

2.5 驗證試驗

驗證結果表明，與對照相比，優化的葉面肥能夠提高油茶幼苗的葉片數目、芽數目和葉芽比值，能夠提高葉片的厚度、柵欄組織和海綿組織的厚度比值以及葉片的上表皮與下表皮的厚度比值(表8)。在葉綠素、可溶性總糖、蛋白質和多酚等生理活性物質的含量以及多酚氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶等氧化酶活性上，優化的葉面肥處理油茶的數據比對照的都要大(表9)。說明優化的葉面肥處理的油茶幼苗生長狀態和生理活性較高，葉面肥能夠促進油茶幼苗的生長發育過程。

表8 優化的葉面肥對油茶幼苗葉芽比和葉片結構的影響Tab.8 Effects of the optimized foliar fertilizer on leaf /bud ratio and leaf structure of C.oleifera seedlings

表9 優化的葉面肥對油茶幼苗生理物質含量和氧化酶活性的影響Tab.9 Effects of the optimized foliar fertilizer on the physiological substance contents and oxidase enzyme activities of C.oleifera seedlings

3 討論與結論

葉面肥是基于植物能夠利用角質層的滲透性及其間隙、氣孔和皮孔來吸收養料的能力而配置成的一種水溶性肥料，主要噴施在葉片、樹干和枝條上，具有用量省、肥效高和針對性強的特點，可以快速補充植物發芽抽枝和開花結果所需要的營養，可以用于根系不發達的幼苗培育及植物的缺素癥的針對性施肥，也可用于微量元素施肥[14-15]，是一種能夠保障植物正常的生長發育所需養料的速效肥。左繼林等[16]研究認為，1.5%尿素能顯著促進油茶幼苗高的生長，0.1%硼肥+0.2%磷酸二氫鉀顯著促進其地徑的生長，0.15%硼能顯著提高油茶葉片的葉綠素含量。葉面肥為3 g/L的尿素和1 g/L的磷酸二氫鉀混合肥對窄葉西南紅山茶(Camelliapitardiivar.yunnanica)苗木樹高、地徑和冠幅的促進作用有顯著影響[17]。油茶苗期對養分需求由多至少的規律為N、K、P，油茶苗期葉面肥N肥總量是關鍵因素，并且適當N、P、K配比能夠促進油茶幼苗吸收微量元素[16]。植物氧化酶類(過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶等)的協同作用，有利于維持活性氧的代謝平衡，保護細胞內的膜結構[19]，有利于植物的生長發育。

由于可溶性總糖是植物生長發育所需的能源物質來源和結構成分之一，并對植物的生長發育和基因表達起調節作用[20]；可溶性蛋白大多數是參與植物體內各種代謝的酶類，是調控植物總代謝能力一個重要指標；葉綠素是植物吸收太陽光能的物質，是植物進行光合作用的前提和基礎；植物氧化酶類是保護細胞結構免受活性氧和過氧化物破壞的蛋白質。植物體內這些活性物質的含量多少和保護酶活性的大小表現出植株生長發育的強弱。礦質元素是植物生命活動過程中不可缺少的無機營養成分。氮是植物體內蛋白質、核酸、磷脂、葉綠素、激素和維生素等的組成元素；磷是核酸、磷脂、核苷酸衍生物(如ATP、FMN、FAD、NAD、COA等)等的組成元素，參與糖類、蛋白質和核酸的代謝活動，也參與細胞分裂和增長；鉀主要以離子形式存在于生命活動旺盛的部位，起酶促作用，也參與糖類的合成和運輸。研究表明適當比例的氮磷鉀肥能夠促進油茶幼苗的生長發育。本文在氮磷鉀肥的基礎上利用正交試驗設計配比硼酸、硫酸鋅、鉬酸鈉等3種無機鹽混合溶液作為葉面肥，研究這些葉面肥對油茶幼苗生長和生理生化特征的影響。結果表明，鉬酸鈉以第1水平的作用，有利于提高油茶葉片數目、芽數目和葉芽比值，提高上部葉和中部葉的柵欄組織和海綿組織的比值，提高POD和SOD酶活性，提高可溶性總糖和蛋白質的含量，表明鉬作為硝酸還原酶的成分，不僅參與氮代謝，也與細胞的分裂和分化密切相關，提高葉片的生長數量。硫酸鋅以第2水平的作用，有利于提高油茶的葉片數和芽數，提高葉片厚度和中部葉的柵欄組織和海綿組織的比例，4種酶的活性較低和葉綠素含量較多，說明鋅作為色氨酸合成酶的輔酶，參與生長素和葉綠素的合成，參與細胞的分裂、生長和分化。硼酸以第2水平的作用，有利地影響油茶芽數和葉芽比，提高葉片柵欄組織與海綿組織的比值，提高蛋白質和多酚的含量，表明硼作為細胞壁半纖維素的組成部分，參與細胞的分裂、生長和分化，與維持葉片和芽的健康生長相關。用優化的葉面肥噴施油茶幼苗的驗證試驗的結果表明，優化水平處理組的各項指標比對照組的都要高，表明優化的葉面肥能夠促進油茶幼苗的生長發育。因此，噴施以N、P、K肥為基礎的鉬酸鈉第1水平(0.01%)、硫酸鋅第2水平(0.05%)和硼酸第2水平(0.2%)的混合葉面肥培養出來的油茶其葉片厚實，葉綠素、可溶性多糖和蛋白質含量豐富，葉芽比例適當，PPO、CAT、POD和SOD等氧化酶活性強，使用該葉面肥能夠培養出生長健壯的油茶苗木。本研究結果將為使用葉面肥來培養生長健壯的油茶實生苗和嫁接幼苗提供參考。