不同套種模式云南核桃叢枝菌根與土壤因子的相關性研究*

李榮波,景躍波,卯吉華,寧德魯,李勇鵬，李孫玲,李舒涵

(1.云南省林業和草原科學院，云南 昆明 650201；2.昌寧縣林業和草原局，云南 保山 678100)

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一類土壤生態系統中重要的有益微生物，能與80%以上高等植物形成叢枝菌根共生體[1]。共生體的形成能促進宿主植物對于水分、礦質營養和有機營養元素的吸收和利用；增強植物對生物和非生物脅迫因子的耐受性和抗性[2-3]。AMF存在于植物根圍土壤中，許多研究表明，AMF的分布與定殖不僅跟宿主植物有關，而且受各種生態因子的影響也較大，尤其受土壤因子的影響尤為突出[4]。如劉振坤等[5]研究了土壤因子對刺槐(Robiniapseudoacacia)AMF影響，張淑容等[6]論述了土壤因子與蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)根圍AMF和DSE的相關性，劉晶等[7]研究了土壤因子對黃土丘陵區不同林地AMF的影響，盛敏等[8]研究了土壤因子對鹽堿地AMF的影響。這些研究對探討AMF與土壤因子之間相關關系提供了參考依據。

核桃(Juglanssigillata)是我國重要的木本食用油料樹種，素有“木本油料之王”稱號[9-10]。云南核桃的種植面積、產量和產值均位居全國之首[11]。核桃已成為極具云南高原特色和影響力的優勢產業[12]。2003年，吳盛強等[13]在開展果樹菌根研究時，發現核桃屬于菌根營養樹種。之后，王進[14]研究了AMF對核桃幼苗接種效應，高婭[15]研究了鹽脅迫下AMF對核桃幼苗生長與生理特性的影響。但對于核桃AMF與土壤因子的相關性方面研究還比較欠缺。本研究通過對云南不同套種模式核桃根系和根際土壤樣品的采集和分析，探討不同套種模式核桃AMF與根際土壤因子的相關關系，旨在從菌根微生態角度提出核桃園科學、合理的土壤管理措施。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本研究采樣點核桃種植園位于昌寧縣田園鎮九甲村，距縣城7 km。該區年均溫15.6 ℃，年均降雨量1 253 mm，≥10 ℃活動積溫5 300～3 600 ℃，無霜期271～233 d，海拔1 620 m，土壤類型為黃紅壤。氣候溫涼濕潤，土壤肥沃、疏松，雨量充沛，日照長，屬核桃生長的最適區域[16]。

1.2 樣品采集與分析

選取目前較普遍的核桃套種模式(均為2009年定植)，即：不套種作物(T1)、核桃+茶樹(Camelliasinensis)(T2)、核桃+豌豆(Pisumsativum)(T3)、核桃+小麥(Triticumaestivum)(T4)、核桃+玉米(Zeamays)(T5)，采用“S型”采樣法，在每種套種模式的種植園中選取6株生長健壯的核桃，在距核桃主干0～30 cm 范圍內，除去地表層雜物，分別從東、西、南、北 4 個方位，在5～20 cm 土層的土壤中采集核桃根系并輕輕抖落附在根系上的根際土壤，用自封袋收集根系和根際土壤并標記樣品編號。樣品帶回實驗室后，根樣置于-20 ℃保存，用于AMF侵染率的檢測；根際土樣自然風干過2 mm篩后置于4 ℃冰箱保存，用于土壤理化成分、酶活性和孢子密度測定。

土壤理化性質按Tan等[17]描述的方法測定。土壤脲酶活性用靛酚比色法測定，堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定，過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測定[18]。

根系處理：根系樣品在堿解離-酸性品紅染色法[19]的基礎上，做稍微調整(以英雄純藍墨水203作為染色劑)后進行制片。按照McGonigle等[20]十字交叉法，在顯微鏡(Olympus BH-2,Japan)下檢測AMF結構在根樣中的侵染情況，AMF各結構類型侵染率計算公式如下：

菌絲侵染率=菌絲侵染的交叉點數和/總交叉點數×100%

叢枝侵染率=叢枝侵染的交叉點數和/總交叉點數×100%

泡囊侵染率=泡囊侵染的交叉點數和/總交叉點數×100%

菌絲圈侵染率=菌絲圈侵染的交叉點數和/總交叉點數×100%

總侵染率=(總交叉點數-無侵染點數和)/總交叉點數×100%

根際土壤處理：稱取每一份風干根際土樣20 g，采用濕篩傾析法[21]分離AMF孢子和孢子果，并在體視顯微鏡下對完整、健康的孢子和孢子果統計孢子數量，以每50 g風干土的孢了個數計為孢子密度。

1.3 數據處理與分析

數據用Excel 2007繪圖，采用DPS 7.05 統計軟件對AMF侵染率、孢子密度和土壤因子進行方差分析、相關性分析、主成分分析和通徑分析。

2 結果與分析

2.1 不同套種模式核桃園土壤特征

2.1.1 不同套種模式核桃園土壤理化指標

由表1可知，在不同套種模式的核桃種植園中，套種茶樹的園地土壤有機質、全氮、水解氮和速效鉀含量均是最高的，而不套種的園地土壤有機質、全氮、全磷、水解氮、有效磷、速效鉀的含量最低。不同的核桃套種模式土壤pH值波動不大，其值介于4.86到5.26之間，均呈酸性土壤。方差分析結果顯示，土壤理化性質在5個種植園中除pH值差異不顯著外，其它土壤因子在不同的套種模式之間有顯著差異。

表1 不同套種模式核桃種植園土壤理化指標Tab.1 Soil physical and chemical parameters of walnut orchards with different intercropping

2.1.2 不同套種模式核桃園土壤酶活性

由圖1可知，脲酶和蔗糖酶活性在T4核桃種植園中最高，在T5核桃種植園中最低；堿性磷酸酶活性在T2種植園中最高，T4中最低；過氧化氫酶活性在T1核桃種植園中最高，在T5核桃種植園中最低。方差分析結果表明：4種土壤酶活性在不同套種模式的核桃種植園之間差異顯著，T4種植園的脲酶和蔗糖酶活性均極顯著高于T5種植園，T4種植園的脲酶活性與T2和T1種植園之間存在顯著差異，其它種植園之間差異不顯著；T1、T2和T5種植園的堿性磷酸酶活性極顯著高于T3和T4種植園，T3和T4種植園的堿性磷酸酶活性也達到極顯著水平；過氧化氫酶活性除T3和T4種植園之間差異不顯著外，其它種植園之間差異均到達顯著水平。

圖1 不同套種模式核桃種植園土壤酶活性Fig.1 Soil enzyme activities of walnut orchards with different intercropping crops

2.2 不同套種模式種植園核桃根系中AMF菌根結構類型、侵染狀況和根際土中孢子密度

通過對染色后核桃根系鏡檢發現，AMF侵染核桃根系形成典型的疆南星型(Arum-type)叢枝菌根，并發育形成菌絲、叢枝、泡囊和菌絲圈4種結構類型(圖2)。說明核桃根系能與根際土壤中AMF形成良好的菌根共生關系。

圖2 核桃根系中AMF侵染結構類型注：H為菌絲，V為泡囊，A為叢枝，C為菌絲圈。標尺=20μmFig.2 Microscopic observation of AMF colonization in roots of walnut

由圖3可知，不同套種模式的種植園核桃根系中AMF的總侵染率從高到低依次為：T2、T1、T5、T4、T3，T2種植園中AMF總侵染率最高，達91.81%，而T3種植園中AMF總侵染率最低，為64.63%。叢枝和菌絲圈侵染率均在T2種植園中最高，分別為68.48%、61.1%。菌絲和泡囊侵染率在T1種植園中為最高，分別為86.06%、49.42%。方差分析結果表明，不同套種模式核桃根系中AMF總侵染率和菌絲侵染率差異顯著，其中套種茶樹和不套種的種植園中AMF總侵染率和菌絲侵染率均極顯著高于套種豌豆、小麥、玉米的種植園，而其他套種模式種植園中AMF總侵染率和菌絲侵染率兩兩之間無顯著差異；套種茶樹的種植園中叢枝侵染率和菌絲圈侵染率都顯著高于其他4個種植園的，其他4個種植園中叢枝侵染率和菌絲圈侵染率差異不顯著；泡囊侵染率在不套種的種植園中極顯著高于其他4個種植園，其他種植園中的泡囊侵染率差異不顯著。

圖3 不同套種模式種植園中核桃根系AMF的侵染狀況Fig.3 AMF colonization in root systems of walnut in orchards with different intercropping crops

從圖4可以看出，不同套種模式的核桃種植園根際土壤中AMF孢子密度變幅較大，介于86～1 442個/50g土之間，孢子密度從高到低依次為T2、T1、T5、T4、T3。差異分析結果表明，T2種植園核桃根際土壤中AMF孢子密度最高(1 442個/50g土)，極顯著高于其它4個種植園，T1和T5種植園之間AMF孢子密度差異不顯著，但均極顯著高于T4和T3種植園，T4和T3種植園之間AMF孢子密度差異不顯著。

圖4 不同套種模式種植園核桃根際土壤中AMF孢子密度Fig.4 Soil AMF spore densities in orchards with different intercropping crops

2.3 核桃根系AMF定殖和根際孢子密度與土壤因子的相關性

由表2可知，根際土壤中AMF孢子密度與土壤pH值、有機質、堿性磷酸酶和脲酶活性顯著正相關，與全磷含量顯著負相關；根系土壤中AMF總侵染率與土壤pH值顯著正相關，與全磷顯著負相關；菌絲侵染率與土壤pH值極顯著正相關，與全磷顯著負相關；叢枝侵染率與全氮和堿性磷酸酶活性顯著正相關；泡囊侵染率與過氧化氫酶活性顯著正相關，與水解氮和速效鉀極顯著負相關，與土壤有機質和全氮顯著負相關；菌絲圈侵染率與全氮和堿性磷酸酶活性顯著正相關。

表2 核桃根系AMF侵染率和根際孢子密度與土壤因子的相關分析Tab.2 Correlation analysis among root AMF colonization,spore density and soil parameters

2.4 不同套種模式核桃園土壤因子主成分分析

由于土壤因子較多，數據分析時可能存在信息的重疊，故在相關分析的基礎上，進一步對數據進行主成分分析，該分析方法通過降維處理，能夠篩選出多個綜合因子中的主要因子。根據特征累積貢獻率大于80%，特征值大于1的原則，入選1個主成分載荷矩陣特征值及貢獻率見表3，主成分累積貢獻率達98.08%，特征值為4.903 8，提取的主成分能反映全部指標信息，土壤中全鉀和全氮的權重得分最高，全磷和有機質也有較高的權重得分。所以全鉀、全氮、全磷和有機質是該研究區核桃種植園中的主要因子，能夠首先反映核桃種植園的土壤營養狀況。

表3 土壤因子主成分得分、特征值、貢獻率和排序結果Tab.3 Principle components,eigenvalue,contribution rate and ranking results of soil factors

通過主成分分析綜合評價不同套種模式核桃園土壤因子狀況，綜合主成分得分與排序見表4。不同套種模式核桃園土壤因子綜合得分排序為T2>T3>T5>T4>T1，套種茶樹的核桃種植園土壤因子綜合得分最高，說明套種茶樹的種植園土壤養分含量較高；而不套種作物的核桃種植園土壤因子綜合得分最低，說明不套種作物的種植園土壤養分含量較低。

表4 不同套種模式核桃園土壤因子綜合得分與排序Tab.4 Comprehensive score and ranking of walnut orchards with different intercropping

2.5 土壤因子與核桃根系AMF總侵染率的通徑分析

由表5可知，各土壤因子對核桃根系AMF總侵染的直接影響順序為：有機質>全鉀>全氮>全磷>速效鉀>pH值>脲酶活性>過氧化氫酶活性>水解氮>速效磷>堿性磷酸酶活性。土壤中的有機質對AMF總侵染率的直接通徑系數最大，為2.209 4，其次是全鉀對AMF總侵染率產生的直接正效應較大，而全氮和全磷對AMF總侵染率產生的直接負效應最大。另外，全氮、水解氮、堿性磷酸酶活性和速效磷通過有機質起間接正效應也較大；全鉀和過氧化氫酶活性通過有機質起間接負效應較大。表明土壤中的有機質含量對AMF總侵染率不僅產生較大的直接作用，同時通過影響全氮、水解氮、速效磷等因子而對AMF總侵染率產生較大的間接作用。

表5 土壤因子(Xi)與AMF總侵染率(Y)的通徑分析Tab.5 Path coefficient between soil factors(Xi)and AMF total colonization percentage(Y)

2.6 土壤因子與根際土中AMF孢子密度的通徑分析

不同套種模式土壤因子與根際土中AMF孢子密度的通徑分析見表6。

表6 土壤因子(Xi)與AMF孢子密度(Y)的通徑分析Tab.6 Path coefficient between soil factors(Xi)and AMF spore density(Y)

由表6可知，各土壤因子對根際土壤中AMF孢子密度的直接影響順序為：有機質>全氮>全鉀>全磷>速效鉀>pH值>脲酶活性>水解氮>堿性磷酸酶活性>過氧化氫酶活性>速效磷。土壤有機質對AMF孢子密度的直接通徑系數最大，為3.074 6，對AMF孢子密度產生的直接正效應最大，其次是全氮、全鉀和全磷的直接作用較大。全氮、水解氮、速效磷、速效鉀和堿性磷酸酶活性通過有機質起間接正效應；全鉀和過氧化氫酶活性通過有機質起間接負效應，通過全氮起間接正效應；土壤有機質、水解氮、速效磷和堿性磷酸酶活性通過全氮起間接負效應。表明土壤中的有機質和全氮通過直接和間接作用對AMF孢子密度產生較大的影響。

3 討論與結論

3.1 不同套種模式核桃根系中AMF定殖狀況

核桃根系中AMF的共生已有研究報道[13]，本研究在云南昌寧采集的核桃樣品中，也發現核桃根系與根際土壤中的AMF形成了良好的菌根共生關系，但不同的套種模式，核桃根系中AMF侵染率及根際土壤中AMF孢子密度差異較大，表明套種作物對核桃根系中AMF的定殖率及土壤中AMF的孢子密度有較大影響。本研究中5個核桃種植園都為10a生的核桃幼樹，但不同套種模式的種植園因套種作物的不同而在施肥和耕作管理方式上各異，從而影響著AMF在核桃根系中的侵染程度。AMF在植物根系中的侵染定殖受土壤營養元素含量、宿主植物種類等多種因素的影響。張之為等[22]研究認為，根際土壤中營養成分對AMF侵染率和孢子密度的影響較大，土壤中有機質含量的增加，會提高宿主植物根系侵染率和根際土壤中的孢子豐度，相反磷元素含量增加，則會降低AMF侵染率和孢子豐度。本研究也得到與之相似的結果，在不同處理中，套種茶樹的種植園土壤的有機質和氮含量最高，磷含量相對較低，結果發現其AMF侵染率與孢子密度最大；套種豌豆的種植園中磷的含量較高，有機質含量較低，其AMF侵染率與孢子密度最小。由此可見，土壤中的有機質和磷是影響AMF與核桃根系共生的重要因素。另外，本研究中AMF侵染率與孢子密度表現出一定的對應關系，核桃根系中AMF侵染率較高的種植園中有較高的孢子密度，這與前人的有些研究結果一致[23]，同時也有研究表明AMF侵染率與孢子密度無嚴格的對應關系[24]，這種差異性的結果可能是受宿主植物種類、土壤質地和地域差異等因素的影響。

3.2 核桃AMF侵染率及孢子密度與土壤因子的關系

本研究的相關分析結果表明，核桃根系中AMF侵染率和根際孢子密度與土壤因子關系密切，AMF總侵染率、菌絲侵染率和孢子密度均與土壤中的全磷含量顯著負相關，這與孫金華等[25]對土壤中叢枝菌根真菌對宿主植物磷吸收作用的研究結果一致；Kowalska等[26]研究發現，磷元素與AMF的形成關系最為密切，磷在AMF的定殖和孢子的生長發育過程中具有重要的調節作用，高磷的土壤環境會抑制AMF的生長和發育，使其菌絲侵染和產孢能力降低。本研究中，套種豌豆的核桃種植園中全磷和速效磷的含量在所有處理中均是最高的，可能不利于AMF菌絲的生長和孢子發育，進而抑制了AMF侵染和孢子萌發。本研究發現，AMF總侵染率和孢子密度與土壤pH值呈顯著正相關，菌絲侵染率與土壤pH值呈極顯著正相關，這與袁鐘鳴[27]對蘇北沿海鹽堿地楊樹(Populuslasiocarpa)、中山杉(Taxodium'Zhongshanshan')、水杉(Metasequoiaglyptostroboides)等造林樹種叢枝菌根真菌與土壤因子相關性的研究結果有所不同。可能是由于本研究的核桃種植園中的土壤pH值總體較低，介于4.86～5.26之間，而AMF定殖和孢子的萌發一般在中性至微酸性的土壤環境中較適宜[7]，因此在土壤偏酸性這樣的環境中，AMF的侵染率和孢子密度呈現出隨著pH值的增大而增加的趨勢。AMF孢子密度、叢枝和菌絲圈侵染率與堿性磷酸酶顯著正相關，這與劉振坤等[5]對刺槐叢枝菌根真菌分布與土壤因子的關系和麻云霞等[28]對渾善達克沙地榆(Vlmuspumilavar.sabulosa)AM真菌的空間分布與土壤因子的相關性研究結果相似，說明土壤中的酶活性與AMF侵染和孢子萌發關系密切，主要是當AMF侵染植物根系后，叢枝菌根會分泌土壤酶，而堿性磷酸酶作為土壤菌根真菌共生分泌的一種特異性酶，其活性能夠反映出AMF的活性與定殖強度[5]。另外，脲酶能把土壤中的有機氮轉化為根際土壤中AMF孢子萌發所需的無機氮，從而促使其形成更多的AMF孢子，而本研究中AMF孢子密度與脲酶活性顯著正相關也充分證實了這一點。AMF孢子密度與土壤有機質含量顯著正相關，這與前人的研究結果[29]一致，一般認為有機質含量高的土壤較有利于AMF產孢，故AMF孢子密度隨著土壤有機質含量的增加而增大。叢枝和菌絲圈侵染率與全氮顯著正相關，這與張淑容等[6]對蒙古沙冬青根圍AMF和DES與土壤因子相關性的研究結果相似，說明土壤中氮元素對叢枝和菌絲圈結構的形成起促進作用。泡囊侵染率與過氧化氫酶活性顯著正相關，與土壤有機質和全氮顯著負相關，與水解氮和速效鉀極顯著負相關，說明過氧化氫酶活性的增加會促進形成更多的泡囊，而土壤肥力(有機質、全氮、水解氮和速效鉀)高則不利于泡囊結構的形成，該現象有待進一步研究。

主成分分析結果顯示，土壤有機質、速效鉀、水解氮和速效磷是影響核桃AMF的主要因子。通徑分析進一步揭示了各土壤因子對AMF侵染率和孢子密度的直接和間接作用，影響根際AMF孢子密度的主要因子為土壤有機質、全氮、全磷和全鉀。其中土壤有機質對AMF孢子密度直接影響系數最大，雖然全氮對AMF孢子密度直接影響作用為負效應，但它通過有機質對AMF孢子密度產生的間接影響系數大于直接影響系數。另外水解氮和堿性磷酸酶活性通過土壤有機質對AMF孢子密度的間接影響系數也大于直接影響系數，且都為正效應，這也佐證了主成分分析中土壤有機質、速效鉀、水解氮和速效磷為影響該研究區核桃根系與根際土壤中AMF的主要因子這一結果。影響根系中AMF總侵染率的主要因子為土壤有機質、全鉀、全氮和全磷，其中有機質和全鉀為正效應，全磷為負效應，全氮的直接影響雖為負效應，但通過土壤有機質產生的間接系數遠大于其直接影響系數，另外水解氮和堿性磷酸酶活性通過土壤有機質產生的間接作用也大于直接作用。說明全氮、水解氮和堿性磷酸酶活性對根系中AMF侵染率的間接作用更大。

本研究結果表明，云南高原山區核桃能與根際土壤中AMF形成良好的菌根共生關系，在不同套種模式的種植園中，核桃根系AMF侵染率和根際土壤中孢子密度差異顯著。相關分析表明，AMF孢子密度與土壤有機質、pH值、堿性磷酸酶和脲酶活性顯著正相關；根系AMF總侵染率與pH值顯著正相關；叢枝侵染率與全氮和堿性磷酸酶活性顯著正相關；菌絲侵染率與pH值極顯著正相關；泡囊侵染率與過氧化氫酶活性顯著正相關；菌絲圈侵染率與全氮和堿性磷酸酶活性顯著正相關。根系AMF總侵染率、菌絲侵染率和根際孢子密度均與全磷顯著負相關；泡囊侵染率與水解氮和速效鉀極顯著負相關。通徑分析表明，土壤有機質對AMF侵染率和孢子密度的直接通徑系數均是最大，其次是全氮通過有機質對AMF侵染率和孢子密度的影響作用最大，土壤有機質和全氮是影響AMF侵染和孢子萌發的關鍵積極因素，而全磷是影響AMF侵染和孢子萌發的關鍵消極因素。因此，土壤中的有機質、全氮和全磷是影響云南高原山區核桃菌根真菌發育的主要因子，在高原山區貧瘠的土壤中，適當地增加土壤有機質和氮的含量，有助于促進種植園中AMF的生長發育。