電針對急性心肌梗死小鼠心肌組織炎癥反應、趨化因子及心肌細胞凋亡水平的影響

趙恬田，國海東，宣守松，李涵，邵水金，牟芳芳

上海中醫藥大學基礎醫學院人體解剖學教研室，上海 201023

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是臨床常見的心血管疾病之一。AMI 起病急，病死率高[1]，預后差[2]，一直是科研工作者研究的重大課題。心肌梗死（myocardial infarction，MI）后組織損傷迅速激活免疫系統，產生炎癥反應，梗死心肌產生的促炎因子如白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等激活白細胞整合素，從而吸引大量炎癥細胞進入梗死區。炎癥反應是心臟修復的必經過程，能促進梗死心肌的清除及心室重構，但過度的炎癥反應又會導致組織損傷加重，影響心臟修復[3]。電針具有雙向調節作用，研究發現，電針能提升MI 療效，調節趨化因子表達變化和炎癥反應[4-8]。因此，炎癥反應和趨化因子可作為研究電針治療MI 作用機理的切入點。本實驗觀察電針對AMI 模型小鼠心肌組織炎癥反應、趨化因子[基質細胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、干細胞因子（stem cell factor，SCF）、單核細胞趨化蛋白 1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）]及心肌細胞凋亡水平的影響，探討電針保護心肌的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF 級成年M-NSG 小鼠，雌性，30 只，體質量（20±5）g，上海南方模式生物研究中心提供，動物許可證號SYXK（滬）2019-0003。飼養于上海南方模式生物研究中心SPF 級動物實驗室，自由攝食飲水。所有實驗均按照上海中醫藥大學倫理委員會和國際動物福利標準的指導方針進行。

1.2 主要試劑與儀器

Fastking cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號KR116），天根生化科技（北京）有限公司；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（貨號11203ES03），上海翊圣生物科技有限公司；OCT 包埋劑（貨號4583），美國Sakura 公司；CD11b（貨號ab8878），美國Abcam公司；Alexa Fluor?555 山羊抗大鼠熒光二抗（貨號A-21434），美國Invitrogen 公司；VECTASHIELD 抗熒光淬滅封片劑（貨號H-1200），美國VECTOR 公司；TUNEL 試劑盒（貨號C1089），上海碧云天生物技術有限公司。華佗牌一次性針灸針（0.25 mm×13 mm，蘇州醫療用品廠有限公司），電針治療儀（KWD 808I，常州英迪電子醫療器械有限公司），熒光定量PCR 儀（LightCycler 96，瑞士Roche 公司），冰凍切片機（HM525，美國Thermo Fisher Scientific 公司），倒置熒光顯微鏡（IX53，日本Olympus 公司），小動物呼吸機（型號7025，意大利Ugo Basile 公司）。

2 實驗方法

2.1 急性心肌梗死模型建立

參考文獻[9]方法，異氟烷氣體麻醉小鼠，氣管插管成功后，連接小動物呼吸機。碘伏消毒皮膚，于左側第4 肋間行橫切口開胸，暴露心臟，剪開心包膜，找到左冠狀動脈起始點（肺動脈圓錐和左心耳之間），在其下方2～3 mm 處結扎左冠狀動脈前降支，肉眼可見左室前壁顏色變白表示造模成功。關閉胸腔，逐層縫合肌肉和皮膚，術后注射青霉素預防感染。

2.2 分組及干預

取正常小鼠8 只設為對照組，正常飼養，不予任何處理。造模成功小鼠16 只（造模過程中死亡6 只）隨機分為模型組和電針組，每組8 只。模型組小鼠與電針組同樣束縛但不電針。電針組參照《實驗針灸學》[10]定位雙側“內關”“心俞”。0.28 mm×15 mm一次性毫針垂直刺入2～3 mm，行提插捻轉手法，左右兩側分別連接電針治療儀，頻率20 Hz 等幅疏密波，電流強度1 mA，留針30 min，每日1 次，分別治療3 d 和7 d，每個時間點4 只小鼠。

2.3 標本采集

分別于電針治療3 d 和7 d 時取材，小鼠麻醉處死，快速取出心臟，PBS 漂洗2 遍。棄去結扎部位以上心肌組織，結扎部位以下心肌組織沿梗死區域中央部位水平切開，分為兩部分。近心底部分放入4%多聚甲醛固定，蔗糖脫水，OCT 包埋，液氮冷凍后制備冰凍切片備用；近心尖部分置入Trizol 中，用于總RNA 的提取。

2.4 免疫熒光染色

取冰凍切片，PBS 洗2 次。滴加0.5%TritonX-100，室溫處理15 min，破膜，增加細胞通透性。PBS 洗3 次×5 min。正常山羊血清37 ℃封閉30 min，封閉非特異性結合位點。滴加一抗，4 ℃孵育過夜。PBS洗3 次×5 min 后滴加對應二抗，37 ℃避光孵育1 h。PBS 洗3 次×5 min。加入DAPI 染細胞核5 min，PBS洗3 次×5 min。用抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。于100 倍顯微鏡下在梗死及周邊區隨機選取3 個視野，通過Image J 圖像分析系統測量相同面積內CD11b 陽性表達的平均熒光強度，取其均數進行統計。

2.5 RT-qPCR 檢測

Trizol 法提取心肌組織總RNA，進行反轉錄，根據PCR 擴增試劑盒說明書配制擴增反應體系混合液，PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s、52 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s 共40 個循環，72 ℃延伸5 min，反應結束后對Ct 值采用2-ΔΔCt法進行定量分析。引物序列由上海生工合成，見表1。

表1 各基因PCR 引物序列

2.6 TUNEL 染色

取固定后冰凍切片，PBS 洗2 次，0.5%TritonX-100室溫處理5 min，破膜，PBS 洗2 次×5 min，每個樣品加TUNEL 檢測液50 μL，37 ℃避光孵育60 min，PBS 洗3 次×5 min，DAPI 染細胞核5 min，PBS 洗3 次×5 min。用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察拍照。采用Image J 圖像分析系統進行定量分析。于100 倍顯微鏡下在梗死及周邊區隨機選取3個視野計數TUNEL 陽性細胞數目和細胞核數目，以兩者比值的均值進行統計分析。

3 統計學方法

4 結果

4.1 電針對模型小鼠心肌組織CD11b 表達的影響

熒光顯微鏡觀察結果顯示，對照組小鼠心肌組織未觀察到CD11b 陽性細胞，模型組小鼠心肌組織可見較多CD11b 陽性細胞表達，電針后小鼠心肌組織CD11b 陽性細胞減少。與對照組比較，模型組小鼠心肌組織CD11b 陽性細胞平均熒光強度顯著增強，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，電針組CD11b 陽性細胞平均熒光強度明顯降低，電針治療3 d時效果較顯著（P＜0.05）。結果見圖1。

圖1 各組小鼠梗死及周邊區心肌組織CD11b 表達比較（，每組4 只）

4.2 電針對模型小鼠心肌組織炎癥因子的影響

與模型組比較，電針治療后促炎因子IL-1β 相對表達水平降低，7 d 時較明顯；TNF-α 表達7 d 時顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；抗炎因子IL-10表達變化不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖2。

4.3 電針對模型小鼠心肌組織趨化因子的影響

與模型組比較，電針組小鼠心肌組織SDF-1 相對表達量7 d 時明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；SCF 相對表達量3 d 時明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；MCP-1 變化不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖3。

4.4 電針對模型小鼠心肌細胞凋亡的影響

對照組心肌組織內凋亡細胞比例極低。與對照組比較，模型組凋亡細胞比例明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，電針組3 d 時凋亡細胞比例明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果見圖4。

圖2 各組小鼠心肌組織IL-1β、TNF-α、IL-10 水平比較（，每組4 只）

圖3 各組小鼠心肌組織趨化因子SDF-1、SCF、MCP-1 水平比較（，每組4只）

圖4 各組小鼠梗死及周邊區心肌組織凋亡水平比較（，每組4 只）

5 討論

AMI屬中醫學“胸痹”范疇，是由于“血凝而不流”導致的心臟脈絡不通。針灸是中醫治療的重要手段，臨床治療心血管疾病眾多穴位中，內關、心俞是最常用的穴位[11-12]。內關屬手厥陰心包經絡穴，也是八脈交會穴之一，與心臟關系密切。心俞為心之背俞穴，是心之經氣輸注出入之處，《素問·舉痛論篇》有“或心與背相引而痛者………寒氣客于背俞之脈………其俞注于心，故相引而痛”。

以往研究[13-14]及本課題組前期實驗均表明，電針“內關”“心俞”對AMI 后心功能具有保護作用，但其機制仍不明確。MI 發生后，IL-1β、TNF-α 等大量炎癥因子被釋放，誘導炎性細胞趨化至損傷心肌組織[15]。強烈的炎癥反應可導致凋亡加重，梗死區擴大。本實驗觀察到，AMI 模型小鼠梗死及周邊區域心肌組織內出現大量CD11b 陽性細胞。CD11b 是白細胞整合素家族成員之一，可標記單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和自然殺傷細胞等，在細胞黏附和炎癥反應中具有重要作用，其活化受到多種趨化因子的調節。本實驗結果表明，AMI 后炎癥反應活躍，大量炎性細胞到達心肌組織，而電針可減少AMI 小鼠心肌組織CD11b 細胞數量，抑制梗死后炎癥反應，且早期效果更為明顯。

本實驗檢測梗死區炎癥因子IL-10、IL-1β、TNF-α的表達，與模型組比較，電針組梗死區抗炎因子IL-10無明顯變化，促炎因子IL-1β 下調、TNF-α 上調。這些細胞因子在心臟損傷及修復中具有雙面性，如TNF-α 既能促進炎癥反應，也能抑制心肌細胞凋亡[16]。本實驗結果提示，電針對炎癥反應的分子調節機制可能具有多效性，具體機制有待進一步研究確認。

MI 后炎癥反應可產生多種趨化因子，如MCP-1、SDF-1 等。本研究檢測梗死及周邊區趨化因子MCP-1、SCF、SDF-1 的表達。其中，SDF-1[17]和SCF[18]能誘導骨髓間充質干細胞歸巢至梗死心肌組織，MCP-1則對單核細胞/巨噬細胞遷移和浸潤的調節起關鍵作用，從而介導炎癥反應[19]。由于成熟心肌細胞再生能力十分微弱[20]，給MI 的治療造成巨大困難。移植外源干細胞或促使內源性干細胞歸巢是研究方向之一，干細胞不僅具有分化為心肌樣細胞的潛能，還可促進血管新生、調節梗死區微環境以減少心肌細胞死亡，從而改善心功能[21]。本研究表明，電針能促進SCF、SDF-1 表達，提示電針對自體干細胞向心肌損傷部位的遷移可能有促進作用，值得進一步研究。

綜上所述，電針保護AMI 小鼠心肌的機制可能與調節AMI 小鼠梗死區炎癥反應、促進趨化因子SCF、SDF-1 的表達相關，從而降低心肌細胞凋亡，本研究為闡明電針治療AMI 提供了新思路。