電針心包經穴對MCAO 大鼠血清和腦組織突觸素及突觸后致密物-95 表達的影響

謝崢嶸 ，肖豆，唐雅妮，柯超，石文英，潘江，章薇，陳成

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

腦梗死是由于不同原因導致動脈狹窄或完全堵塞，使腦組織缺血、缺氧、壞死，引起神經功能障礙的一種腦血管疾病。通過調控機體相關突觸可塑性物質的表達可促進神經功能的修復[1]。突觸素（synaptophysin，SYP）作為一種特異性標志性囊泡蛋白[2]，與突觸的結構和功能有著密切的關系，可直接反映突觸的數量和密度分布，突觸后致密物-95（postynaptic density，PSD-95）是突觸后膜上最主要的神經細胞骨架蛋白，參與突觸的連接與形成，維持突觸的可塑性[3-4]。SYP、PSD-95 不僅是是突觸前后的重要標志物，也是突觸可塑性標志物[5]。本研究采用局灶性腦缺血模型（MCAO），觀察電針心包經穴對模型大鼠血清及腦組織SYP 和PSD-95 表達的影響，探討針刺對腦缺血后突觸可塑性的作用機制，為臨床應用心包經穴治療腦缺血提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級健康成年雄性SD 大鼠90 只，3～4 月齡，體質量220～250 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號SCXK（湘）2016-0002。實驗前所有動物均在安靜環境下飼養，室溫22 ℃，相對濕度55%～70%，其飼養籠具、墊料、飼料、飲水均按照SPF 級實驗動物要求進行制備和消毒，造模前禁食24 h。實驗過程中對動物的處置遵循中華人民共和國科學技術部2006 年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》及倫理學規定。

1.2 主要試劑與儀器

SYP 聯酶試劑盒（CSB-E13827r），武漢華美生物工程有限公司；PSD-95 聯酶試劑盒（ml028404），上海聯酶生物科技有限公司；miRNA 反轉錄試劑盒（CW2569），北京康為世紀生物科技有限公司；DM2000Plus DNA Marker（CW0632），北京康為世紀生物科技有限公司。SDZ-Ⅱ華佗電針治療儀、華佗牌0.30 mm×15 mm 一次性針灸針（蘇州醫療用品廠有限公司），臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，H1650R），全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發展有限公司，PW-812），多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司，MB-530），熒光定量RCP 儀（美國Thermo 公司，PIKOREAL96），熒光PCR 板（美國Thermo 公司，SPL0960），電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-2C）。

1.3 分組、造模及干預

參照Longa[6]和Koizumi[7]方法制備MCAO 大鼠模型，即頸外動脈插入線栓法建立MCAO 左側腦缺血模型。大鼠造模完成后采用Zea Longa 5 級4 分制評分：無神經功能缺損計0 分；梗死對側前爪內收、伸直障礙計1 分；向偏癱側轉圈者計2 分；行走時向偏癱側傾倒計3 分；意識喪失、不能行走計4 分。選取評分為1～3 分大鼠納入觀察。動物分組采用先造模后分組方式，將90 只大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、心包經組、肺經組，每組再分為14、21、28 d 3 個時間點，每個時間點6 只。正常組正常喂養，予以捆綁處理；假手術組分離出血管后不插線，捆綁處理；模型組捆綁處理；心包經組電針心包經穴；肺經電針肺經穴。

1.4 針刺方法

根據《實驗針灸學》[8]動物穴位圖譜及擬人比照法定位：按經脈“從胸走手”的循行方向，依次選取右側癱瘓肢體不同節段的常用穴位作為心包經、肺經的代表穴，手厥陰心包經選取“大陵”“內關”“曲澤”“天泉”，手太陰肺經選取“太淵”“列缺”“尺澤”“天府”。

正常組、假手術組、模型組捆綁30 min 處理，不行電針剌激。心包經組、肺經組成模后第2 日開始每日電針治療，每次30 min，連續電針6 d，間隔1 d，繼續電針，分別至14、21、28 d 取材。大鼠捆綁后用0.3 mm×15 mm 毫針刺入大鼠右側穴位，手厥陰心包經“天泉”“曲澤”一組、“內關”“大陵”一組，手太陰肺經“天府”“尺澤”一組、“列缺”“太淵”一組。以上穴位接SDZ-Ⅱ華佗電針治療儀，極性固定，近心端接正極，遠心端接負極。電針刺激參數：連續波，輸出電壓2～4 V，輸出電流4～6 mA，強度以局部組織輕顫為度。

1.5 檢測指標

1.5.1 血清突觸素和突觸后致密物-95 含量檢測

治療結束后，大鼠10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，靜置2 h，3000 r/min 離心15 min，嚴格按照試劑盒說明書操作，ELISA 檢測大鼠血清SYP和PSD-95 含量。以標準品濃度為縱坐標，OD 值為橫坐標，使用Curve Expert 軟件進行分析，并根據提示制作標準曲線。根據標準品的濃度與OD 值計算回歸方程，將樣本OD 值代入方程式，計算樣本濃度再乘以相應的稀釋倍數，即為樣本的實際濃度。

1.5.2 腦組織突觸素和突觸后致密物-95 mRNA 表達檢測

治療結束后，處死大鼠，斷頭取腦，切取病灶側腦組織，RT-qPCR 檢測腦組織SYP、PSD-95 mRNA表達，提取RNA 標本次日備用，121 ℃、60 min 濕熱滅菌，烘干。取保存在Trizol 中組織約0.02 g，加入1 mL Trizol 于勻漿器中充分研磨勻漿，混勻后室溫裂解5 min；取上層液，轉移至新的RNase-Free 離心管中；加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置10 min；4 ℃、12 000 r/min 離心3 min，棄上清液；干燥5～10 min。加入20～30 μL 無菌無酶水溶解沉淀；紫外分光光度計測定濃度，吸取2 μL RNA 溶液于石英比色杯，用無酶水定容至100 μL，于260 nm 與280 nm波長處測其吸光度，計算其濃度和純度，比值在1.8～2.0。運用Primer5 軟件設計引物，引物由上海生工合成。實時定量PCR 引物序列見表1。

表1 各基因PCR 引物序列

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 電針心包經穴對模型大鼠血清突觸素和突觸后致密物-95 含量的影響

與正常組、假手術組比較，模型組大鼠血清21、28 d SYP 和PSD-95 含量均明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，心包經組大鼠血清21 d SYP 含量明顯升高，28 d PSD-95 含量明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與同一時間點肺經組比較，心包經組大鼠血清各時間點SYP 和PSD-95 含量均升高，除28 d SYP外差異均有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠血清SYP、PSD-95 含量比較（，ng/mL）

表2 各組大鼠血清SYP、PSD-95 含量比較（，ng/mL）

注：與正常組、假手術組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與肺經組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01

2.2 電針心包經穴對模型大鼠腦組織突觸素和突觸后致密物-95 mRNA 表達的影響

與正常組、假手術組比較，模型組大鼠腦組織SYP、PSD-95 mRNA 表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，心包經組大鼠腦組織SYP、PSD-95 mRNA表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與同一時間點肺經組比較，心包經組大鼠腦組織SYP、PSD-95 mRNA表達明顯升高（P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠腦組織SYP、PSD-95 mRNA 表達比較（）

表3 各組大鼠腦組織SYP、PSD-95 mRNA 表達比較（）

注：與正常組、假手術組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與肺經組比較，●●P＜0.01

3 討論

目前，針灸作為一種干預腦卒中發生及改善其肢體功能障礙、言語困難等癥狀的有效手段被臨床廣泛運用，其治療機制的研究也日益深入。許多研究表明，針刺“足三里”“百會”等可通過抑制炎癥因子、保護神經細胞、促進神經生長因子等作用對抗腦缺血損傷[9-11]，但多為督脈或陽明經穴，而運用心包經穴與他經對比研究鮮有報道。手厥陰心包經雖未直接聯系腦，而其“主脈所生病”可直接調控心主血脈功能，間接起到影響腦血管功能的作用，即心包經-心主血脈-疏通腦絡（靶器官效應），而肺具有朝百脈、主治節的功能，通過肺氣的運動輔心行血，調節全身血流，可對腦血管功能產生影響，故而選用心包經與肺經對比。本研究團隊前期從抗缺血后細胞凋亡及炎性物質的角度開展針刺心包經與腦關系的研究，發現針刺手厥陰心包經穴對MCAO 大鼠具有不同程度的治療效應。針刺“內關”等可穩定心電活動、抑制心肌酶、調控血清白細胞介素-1β（IL-1β）的水平，并可抑制腦細胞凋亡蛋白Bax、IL-1β 及轉化酶Caspase-1 mRNA 在腦組織的表達；電針心包經穴能促進腦組織神經生長因子表達，起到促進缺血半暗帶血管新生、修復神經的作用[12-15]。形成從腦病及心→從心治腦→針刺效應→物質變化→臟腑效應等多層次、多角度初步探討心腦相關的規律及聯系途徑。

SYP 作為一種特殊的突觸囊泡蛋白，是突觸可塑性的特異性分子標志物[16]，可通過影響突觸結構和神經遞質釋放調節突觸可塑性，SYP 參與Ca2+依賴神經遞質釋放和囊泡運輸，其表達水平間接反映突觸結構的完整性和功能狀態。SYP 的增加表明突觸數量、突觸傳遞功能和突觸可塑性的增加[17]。在中樞神經系統損傷中，SYP 的表達都伴有不同程度變化，PSD 是突觸后信號整合的關鍵物質，對突觸效能傳遞影響十分重要[18]。采用雙側頸總動脈閉塞術制備的慢性腦低灌注大鼠模型中發現大鼠海馬區SYP 表達含量下降，且伴有不同程度的行為學改變[19]。PSD-95 作為突觸后致密物中含量最豐富的結構蛋白，同時也是一種錨定蛋白，其本身無蛋白酶的活性，主要通過其自身不同的結構域與N-甲基-D-天冬氨酸受體、鉀離子通道、細胞黏附因子、細胞質蛋白互相結合，形成相關的信號復合物，參與突觸的生長與連接，維持和調控神經元突觸的可塑性[20-21]。在永久性局灶性MCAO 腦缺血模型大鼠中發現，皮質層和海馬區PSD-95 含量明顯減少，并且其表達與腦缺血損傷的程度密切相關[22]。

本研究采取針刺手厥陰心包經穴為外源性干預手段，觀察不同時間點梗死大鼠血清及腦組織SYP和PSD-95 的表達。本實驗結果表明，針刺心包經穴、肺經穴可提高21 d 血清SYP 和21、28 d 血清PSD-95的含量，且具有經脈特異性，心包經組優于肺經組，但就兩者總體的表達趨勢而言，存在時間點表達上的不穩定性，考慮腦梗死病變部位在腦，并且SYP 和PSD-95 作為中樞神經系統突觸前、突觸后的特殊分子標志物，可能其作用的最終靶點應在腦組織，并非是血清。而針對腦組織SYP、PSD-95 mRNA 的表達，本實驗結果顯示，電針心包經穴能明顯提高不同時間點腦組織SYP、PSD-95 mRNA 的表達，且心包經作用優于肺經組，這可能與部分學者認為在腦缺血損傷后PSD-95 的含量在14 d 后明顯增加或可能處于腦梗死恢復期，已經發生了突觸的重塑有一定關聯[23-24]。本實驗肺經組對部分時間點血清SYP 和PSD-95 的含量及21 d 梗死區SYP mRNA 的表達產生作用，可能與朝百脈、主治節，調節全身血流的作用有關，但目前缺乏其他研究對照，考慮與樣本量小有關。

綜上，電針心包經穴可提高梗死大鼠血清SYP和PSD-95含量及腦組織SYP、PSD-95 mRNA的表達，調節腦缺血后突觸的可塑性，為臨床上運用心包經穴治療腦缺血提供了一定的實驗依據。