低氧對蝦類影響的研究進展

王盼，史文軍，萬夕和，沈輝，黎慧，王李寶，楊澤禹，胡潤豪，吳旭干

（1.江蘇省海洋水產研究所，江蘇 南通 226007；2.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；3.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003）

低氧通常指水中的溶解氧含量降低，當溶解氧水平低于2～3 mg/L 時，就會出現低氧，這種水體被稱為低氧水體[1]。在定義低氧時考慮的生物對象不同，不同生物體獲得氧氣的能力和代謝需求也存在差異，因此一種較為合理的定義認為：在水體溶解氧含量高于一個臨界值（critical oxygen level,COL）時，其耗氧率不受溶解氧降低的影響來界定水體是否低氧，而溶解氧含量低于這個臨界值即為低氧[2]。水生環境中的溶解氧量極易受溫度、鹽度、水深和大氣壓等外界環境因素的影響[3]。近年來，工業廢水排放增加引起的水體富營養化，溫室效應引發的氣候變暖以及突變天氣或災難性天氣的發生，水體低氧現象日益頻繁發生；此外，水生動物在長途運輸過程中也常出現低氧現象[4]。低氧不僅引起蝦類行為的改變，也引起其生理生化方面的變化，對蝦類的生命活動產生重要影響。

1 低氧對蝦類存活的影響

不同品種蝦類對低氧的耐受能力不同，同一種類不同品系或不同規格的蝦對低氧的耐受能力也存在差異（表1）。

表1 蝦類的窒息點Tab.1 Asphyxia points of shrimp

2 低氧對蝦類行為的影響

不同蝦類耐低氧能力不同在低氧環境下的行為也有所不同。低氧會引起蝦類行為的改變，如跳躍、緩行或向常氧區遷移等。DO 小于2 mg/L，蝦類活動增強，并出現眼柄快速運動及觸角、鱗屑和腹部彎曲[21]。日本對蝦（Penaeus japonicus）在低氧環境下首先出現短時間持續游動[22]，然后靜伏于底部，游泳足間隔性高頻劃水，幅度隨著DO 的繼續下降而減弱，當DO 低于1 mg/L，部分蝦體開始側偏。中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）在DO 3 mg/L 時游泳速度開始下降[23]，長期低氧對其臨界游泳速度和甩尾速度的影響更明顯。而一些蝦類可避開低氧環境向常氧區域遷移，如褐美對蝦（Penaeus aztecus）在DO 2 mg/L、白對蝦（Penaeus setiferus）在DO 1.5 mg/L 時都會表現強烈的逃避反應[21]；刀額新對蝦[13]（Metapenaeus ensis）、口蝦蛄[24]（Oratosquilla oratoria）、淡水小龍蝦[25]（Paranephrops zealandicus）等也被發現存在類似的低氧逃避行為。潛沙性蝦類在低氧時則從沙中露出，如褐蝦[26]（Crangon crangon）在DO 降低后，體前端首先從沙中抬出，而后蝦體逐漸露出，活動增強，當氧飽和度降至30%后，活動逐漸停止。

低氧環境下蝦類可提高呼吸頻率，增加流經鰓腔的水流以滿足機體對氧的需求。研究發現：隨著氧分壓的下降，長臂蝦[27]（Palaemon adspersus）顎舟葉擺動頻率不斷增加，在40 mm Hg 附近時達到最大值，當氧分壓降低到40 mm Hg 后，顎舟葉的擺動頻率下降到原來的70%左右；凡納濱對蝦[28]在DO低于3 mg/L 時，顎舟葉的擺動頻率隨DO 下降而升高，但當DO 降到1.43 mg/L 以下時，顎舟葉的擺動頻率明顯下降，直至死亡才停止。部分穴居蝦類在低氧時會把頭胸部露出水面，鰓后部浸入水中，從鰓腔排水或通過腹肢拍打將更多的含氧水灌入洞穴，以補充氧氣的供應[29,30]。

3 低氧對蝦類的生長的影響

低氧影響蝦類攝食、消化和蛻皮等正常生理活動，進而影響蝦類的生長。韓絲銀[31]發現，在循環重/中度低氧條件下，凡納濱對蝦的增重率和增長率降低，消化酶活性下降，其中胰蛋白酶下降最多。胡賢德[32]等研究發現，低氧環境下，斑節對蝦（Penaeus monodon）和日本對蝦的飼料利用率較低，生長受到抑制，而當水體DO 保持在3.5 mg/L 以上時，蝦的飼料利用率高，生長正常。凡納濱對蝦幼體可以在較低的DO 水平下存活，但低于4 mg/L 時生長速度下降[33]。水體DO 低于4.13 mg/L 時，中國對蝦的生長受到抑制，攝食量和飼料利用率也逐漸降低[2]，DO低于3 mg/L 時其攝食量顯著降低，低于2 mg/L 后攝食基本停止[34]。水體DO 低于2 mg/L 時，凡納濱對蝦仍可攝食，但攝食量明顯減少，生長受到抑制[35]。水體氧飽和度低于50%時美洲螯龍蝦（Homarus americanus）殼的硬度降低、蛻皮周期延長，體質量降低[36]。長期低氧抑制短溝對蝦（Penaeus semisulcatus）蛻皮，影響其正常生長[37]。

4 低氧對蝦類生理生化的影響

蝦類可以不同生理方式來調節機體，以適應非致死性低氧環境，主要包括調節心率、呼吸代謝方式、血藍蛋白含量、免疫能力、抗氧化能力以及滲透能力等。

4.1 呼吸

在低氧環境下，蝦類可增加心搏量（stroke volume,Vs）維持心臟輸出量（cardiac output,Vb），補償低氧引起的心率（heart rate,fH）過緩，如克氏原螯蝦[38]、美洲螯龍蝦[38]；刀額新對蝦[13]的心率隨著水體DO 濃度的降低而下降。而短刀小長臂蝦Palaemonetes pugio[39]維持Vb 的機制卻不相同，從常氧環境降到中度低氧13.3 KPa 環境中時，其通過fH 的增加來維持Vb，從而補償VS 的減少。但Guadagnoli等[40]發現，短刀小長臂蝦在13.7 KPa 和10.3 KPa 氧分壓水體中，fH、Vs 和Vb 沒有變化，氧分壓降至6.8 KPa 以下時，fH 和Vb 顯著下降，而Vs 下降不明顯。

4.2 代謝

在低氧環境下，蝦類可調節呼吸代謝方式，從有氧代謝轉變為無氧代謝，以糖酵解方式獲得部分能量，終產物乳酸積累增多。在低氧下凡納濱對蝦血液中乳酸和葡萄糖水平顯著增加；而肌肉中乳酸和葡萄糖濃度卻沒有變化[41,42]。研究中發現，在臨界氧閾值以下，北方長額蝦（Pandalus borealis）參與無氧代謝的乳酸脫氫酶（LDH）、丙酮酸激酶（PK）和磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PEPCK）的活性在雌蝦中下降，而在雄蝦中只有PEPCK 活性下降[43]。隨著低氧暴露時間的延長，日本沼蝦肝胰腺和肌肉組織細胞色素氧化酶（CCO）和琥珀酸脫氫酶（SDH）活力顯著下降，延胡索酸還原酶（FRD）和LDH 活力顯著上升[41]。低氧3 h 后，凡納濱對蝦果糖1,6-二磷酸酶（FBP）在肝胰腺的表達下降，24 h 后恢復，48 h 增加了40%；在鰓和肌肉中都明顯減少；而低氧誘導肝胰腺磷酸果糖激酶（PFK）的表達量增加了90 倍，鰓中的PFK 在低氧24 h 內沒有明顯變化，48 h 增加了1.5 倍[42]。在低氧脅迫下甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達也增加[44]。低氧環境下的糖酵解速率加快意味著低氧組織對葡萄糖的需求更高，葡萄糖在不同類型轉運蛋白的幫助下促進轉運進入細胞[45-47]。然而部分蝦類如泥蝦（Calocaris macandreae）無氧代謝只在嚴重低氧時才開始[45]。

4.3 血藍蛋白

血藍蛋白是蝦類血淋巴中含銅的氧轉運蛋白，占血淋巴總蛋白的90%以上，其合成代謝與水體DO 變化直接相關[46]。水體DO 變化時，蝦類可啟動血藍蛋白的合成，保證正常的呼吸代謝。Hagerman[47]等研究發現，蛻皮間期，褐蝦血藍蛋白平均濃度為0.5～0.6 mmol/L，低氧7 d 和14 d 后分別上升至0.8 mmol/L和1.3 mmol/L。黃天鴿等[46]研究也發現，在低氧下凡納濱對蝦血藍蛋白含量上升，復氧后恢復。

4.4 免疫

蝦類的免疫防御主要依賴血細胞的凝血、吞噬、包裹和傷口愈合等功能[48]。低氧影響蝦類的免疫系統，降低蝦類對病原細菌如弧菌的定位與清除[49]。低氧下，細角對蝦[50]（Penaeus stylirostris）的大顆粒細胞、半顆粒細胞、透明細胞以及總血細胞數量都下降，酚氧化酶活性增加；感染弧菌后相對于實驗組蝦的死亡率提高，說明低氧降低了蝦對弧菌的抵抗能力。羅氏沼蝦[51]長時間暴露在低氧環境下總血細胞和透明細胞數量也顯著減少。在低氧環境下凡納濱對蝦血淋巴的溶菌活性和抗菌活性也顯著降低[52]。因此，低氧會引起蝦的免疫能力下降，降低對病原菌的抵抗力[53,54]。

4.5 抗氧化能力

低氧可誘導蝦類產生活性氧，破壞細胞內大分子，不利于維持細胞穩態。良好的抗氧化防御系統是應對氧化損傷的有效策略。這主要包含一些抗氧化酶系，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）等。研究發現，不同種蝦、同種蝦不同組織、低氧時間以及復氧前后，蝦類抗氧化酶活性都存在顯著差異。臨界氧閾值以下北方長額蝦肌肉中SOD 活性下降，雌蝦下降33%，雄蝦下降達70%；肝胰腺中SOD 活性，雌蝦下降62%，雄蝦下降52%；雌蝦肝胰腺GPx 酶活性沒有變化，而雄蝦升高[43]。凡納濱對蝦[55]低氧下肌肉組織中SOD 活性顯著升高，復氧1 h 后活性較低；在肝胰腺組織中，SOD、CAT 和GPx 酶在低氧下都表現出活性增加，復氧1 h 后SOD 和GPx 活性明顯降低，3 h 后又顯著升高，表明低氧-復氧對抗氧化酶活性有影響。另有研究發現，低氧6 h 和24 h 時，凡納濱對蝦鰓中CAT 活性分別增加3.2 和2.4 倍[56]。隨著低氧時間的延長，日本沼蝦肌肉中SOD、CAT和GPx 3 種酶活力均呈現先升高后降低的變化趨勢；鰓組織中SOD 和CAT 酶呈現先升高后下降，GPx 酶在低氧期間一直呈升高趨勢[57]。

4.6 滲透壓

滲透調節能力是水生動物維持機體穩態的主要方式之一[58]，蝦類血淋巴滲透壓的調節主要依賴于無機離子濃度。水體DO 低于3 mg/L 時，蛻皮期，細角濱對蝦的滲透調節能力下降，6 h 達到最低[59]。褐蝦隨著氧張力的下降，血淋巴氯離子流失，鈣離子濃度增加，總血淋巴滲透值保持相對恒定[60]。在循環重/中度低氧下，血淋巴離子調節基因的轉錄在短期內增加，之后恢復正常或下降，表明蝦長期低氧環境下滲透調節機制可能被損壞[30]。羅氏沼蝦[61]和凡納濱對蝦[62]滲透調節能力在低氧下也都呈下降趨勢。

總的來說，蝦類應對低氧應激的生理調節方式主要涉及3 種：首先提高呼吸頻率，增加流經鰓上的水流，增加氧結合蛋白的含量來維持氧的輸送。其次是減少機體耗能量，主要表現為以伏底等來減少運動，減緩消耗運動消耗，最后是轉變代謝方式，以無氧代謝途徑補充能量，緩解部分能量的消耗。

5 低氧對蝦類組織結構的影響

組織學是病理檢查的標準方法，可以用來評估生物體的健康情況[63]。甲殼動物的鰓是呼吸、排泄和滲透調節的重要器官，直接與水體接觸，也極易受環境影響及病害損傷[64]。Sun 等[65]研究發現，低氧下日本沼蝦鰓組織結構表現為血細胞浸潤、鰓片腫脹壞死、排列紊亂。肝胰腺是消化、吸收、儲存和代謝的主要器官，在蝦的防御過程中也起重要作用[66]。楊明等[62]研究表明，低氧條件下日本沼蝦肝胰腺組織分泌細胞運轉泡體積減小，數量降低。韓絲銀[30]研究發現：循環重/中度低氧下凡納濱對蝦肝胰腺組織小管管腔逐漸空泡化，最后破裂使上皮細胞層變薄。有關研究也表明，低氧還會損傷對蝦的肌肉[67]、中腸[30]和線粒體超微結構[68]。

6 低氧對蝦類相關基因的影響

6.1 低氧誘導因子（HIF）

低氧誘導因子（HIF）是氧穩態和低氧適應性反應的主要調控因子，可以調控許多基因的轉錄，參與控制細胞對低氧的系統反應。其中有的基因是通過增加葡萄糖攝取和糖酵解來促進細胞對低氧的適應，有的是控制促進紅細胞成熟或者血管生成和血管舒縮來增加組織對氧氣的轉運能力[69,70]。HIF是異質二聚體，由α 和β 亞基組成；氧調控HIF介導的轉錄激活有多個步驟，主要通過HIF-1α 介導。HIF-1α 具有氧依賴降解區（ODD）和C 末端反式激活結構域（C-TAD），在常氧量條件下，這些區域內保守的脯氨酸和天冬酰胺殘基被一系列羥基酶羥基化，HIF-1α 迅速被腫瘤抑制蛋白降解；在低氧條件下羥基化程度降低，導致HIF-1α 積累并與HIF-1β 相互作用，誘導靶基因的轉錄[71]。蝦類以系列的分子機制適應低氧環境。

目前有關蝦類HIF-1 的研究多在于序列的克隆以及低氧下的差異表達。Li 等[72]發現，短刀小長臂蝦的HIF-1α 與脊椎動物相似，有一個螺旋-環-螺旋（bHLH）結構域、兩個PAS 結構域、一個有兩個脯氨酸羥基化修飾位點的氧依賴降解區（ODD）和一個有天冬酰胺羥基化修飾位點的C 端反式激活結構域（C-TAD）；但是，短刀小長臂蝦HIF-1α中一段長230 個氨基酸的獨特序列，在其他任何脊椎動物中都沒有發現。凡納濱對蝦[73]、日本沼蝦[74]、日本對蝦[75]的HIF-1α 也具有這些基本結構域。凡納濱對蝦不同組織在低氧狀態與常氧狀態下HIF-1α 與HIF-1β 轉錄水平差異顯著，常氧狀態下鰓的HIF-1α 轉錄水平比肌肉和肝胰腺高，低氧狀態下（1.5 mg/L DO 脅迫24 h），鰓、肌肉和肝胰腺的HIF-1α 轉錄水平分別下降了35 倍、50 倍和18倍；而HIF-1β 的轉錄水平在鰓中下降了1.8 倍，在肌肉中卻增加了4 倍，肝胰腺中卻沒有發生顯著變化[77]。Sonanez-Organis[76]等也發現，在低氧狀態下凡納濱對蝦鰓中和肌肉中HIF-1α 轉錄水平顯著下降。而日本沼蝦在低氧條件下（2.0 mg/L），鰓和肌肉中HIF-1α 的mRNA 表達量在低氧1 h、3 h 和24 h均顯著增加，HIF-1β 的mRNA 表達量卻無顯著變化[78]。日本對蝦內腸HIF-1α 和HIF-1β 的基因表達量在低氧24 h 也都顯著增加[79]。Cota-Ruiz[77]等發現，低氧脅迫3 h 凡納濱對蝦肝胰腺中HIF-1α 的轉錄水平是低氧脅迫48 h 的6.4 倍，表明短期缺氧會導致HIF-1α 的轉錄水平顯著增加，而在長期低氧下，HIF-1α 轉錄水平則傾向于減少。

6.2 線粒體基因

線粒體是動物進行有氧呼吸代謝的重要細胞器，受胞內氧濃度的影響線粒體相關基因的表達。研究表明，在中度低氧（2.5 mg/L）下短刀小長臂蝦線粒體基因的表達不受影響，嚴重缺氧環境（1.5 mg/L）下發生顯著改變，編碼Ccox1、16S rRNA、血紅素結合蛋白和鐵蛋白的基因在暴露7 d 后顯著上調；14 d 后表達模式發生逆轉，Ccox1、Ccox3、cytb、16S rRNA、血紅素結合蛋白和鐵蛋白基因表達顯著下調[78]。Romero 等[79]研究發現：凡納濱對蝦線粒體解耦聯蛋白活性在缺氧和復氧過程中被激活，控制蝦體內活性氧的產生和氧化損傷。

機體生命活動所需要的能量是線粒體通過ATP 酶合成產生，低氧環境下線粒體不能正常為細胞的生命活動提供能量，各器官不能發揮正常功能。無脊椎動物中，ATP 濃度可能會根據物種對環境氧濃度的變化作出適度或劇烈下降[80]。但研究發現，凡納濱對蝦[81]低氧時肌肉中ATP 的含量沒有發生改變，復氧過程中，ATP 濃度較常氧和低氧時下降；表明凡納濱對蝦肌肉在低氧下能夠保持足夠的ATP 濃度，這可能是由使用其他能量源來實現的。

6.3 其他低氧相關基因

除了上述相關基因外，還有一些基因參與調控蝦類適應低氧環境。進化上高度保守的熱休克蛋白（HSP）是具有分子伴侶、抗氧化、協同免疫和抗細胞調亡作用的蛋白分子家族[82]。生物可通過提高熱休克蛋白的表達量使機體適應環境變化。Li 等[83]研究發現，中國對蝦熱休克蛋白90（HSP90）對低氧非常敏感，低氧2 h 其血細胞和鰓中HSP90 的轉錄水平升高，低氧8 h 時，其轉錄水平被抑制；在經歷5 d的低氧復氧變化后，150 h 低氧下血細胞和鰓中的轉錄水平均處于上調狀態。蝦的HSP90 轉錄水平因低氧而發生改變，在蝦類應對環境協迫時發揮著重要作用。

P53 在低氧下也被激活，主要參與細胞周期調控、誘導凋亡、抑制腫瘤、調節代謝途徑、細胞衰老和DNA 修復等。p53 的表達和反應在很大程度上取決于細胞類型。凡納濱對蝦低氧48 h 血細胞P53 轉錄水平顯著降低[84]，這與日本沼蝦[85]肝胰腺相反。miRNA 是一組約長22 個核苷酸的非編碼RNA，可以導致靶mRNA 的降解和翻譯停滯[86]。有研究表明：其在生物體適應環境壓力中發揮重要作用。低氧下凡納濱對蝦[86]大部分miRNA 的表達水平處于上調水平，日本沼蝦[87]低氧下miRNA 的表達水平也有上調和下調的變化。

7 總結與展望

綜上所述，水體DO 量下降影響對蝦類的多方面，如引起蝦類的行為、生長、生理生化、組織結構和基因方面的變化。低氧環境下，蝦類通過調節心率、呼吸代謝方式、血藍的蛋白含量、免疫能力、抗氧化能力以及滲透能力等來抵抗低氧。近些年來，低氧對蝦類影響的研究越來越多，且已深入到細胞水平和分子水平，旨在揭示低氧對蝦類的影響和蝦類是如何通過自身的調節來抵抗并適應低氧環境，以期為防控因天氣、溫度以及其他生態環境因素造成的水體DO 下降而導致的蝦類死亡提供資料。隨著分子技術手段的進步，低氧對蝦類影響的研究將進一步推進，相關機制也會被逐步解開。

自然環境條件下，水體DO 量逐步降低，低氧環境也是逐步形成。目前，已有的研究主要是將蝦類直接從常氧水體轉移至低氧水體中研究低氧脅迫。這種低氧處理方式可能不能夠很好地反應在實際養殖生產中低氧環境的形成，因此，未來研究應更多地結合生產實際，通過模擬自然環境下水體低氧的形成來研究低氧對蝦類的影響。