母乳低聚糖組成及其對(duì)益生菌的增殖作用

揭 良，蘇米亞，賈宏信，陳文亮，齊曉彥

（乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436）

母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是結(jié)構(gòu)多樣的非共軛低聚糖，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類較多，HMOs結(jié)構(gòu)由5 種基本單糖單體組成，單糖單體分別為D-葡萄糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、L-巖藻糖和唾液酸，聚合方式為在乳糖基礎(chǔ)上以β-1,3或β-1,6鍵連接半乳糖β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖雙糖（雙糖稱為lacto-N-biose），形成HMOs的核心結(jié)構(gòu)，在乳糖或核心結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上可以再延伸，進(jìn)行巖藻糖化或唾液酸化[1]。母乳中的低聚糖含量遠(yuǎn)高于牛乳，其中被報(bào)道的HMOs超過(guò)200 種，但研究報(bào)道較多的是20多種常見(jiàn)HMOs[2-3]。國(guó)外研究報(bào)道成熟期母乳中HMOs含量為5～15 g/L，是母乳中第三大固體成分[4-5]。HMOs按結(jié)構(gòu)不同主要分為中性巖藻糖基化、中性非巖藻糖基化和酸性唾液酸化HMOs三大類，其中中性HMOs占比最大，2’-巖藻糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）、乳酰-N-巖藻五糖Ⅱ（lacto-N-fucopentaose Ⅱ，LNFPⅡ）和乳糖-N-四糖（lacto-Ntetraose，LNT）是含量較為豐富的中性HMOs[6-8]。

母乳是嬰兒出生后最初6 個(gè)月的唯一食物，若母乳喂養(yǎng)不能實(shí)現(xiàn)時(shí)，嬰兒配方乳粉作為替代品也是低聚糖的一個(gè)可能來(lái)源。低聚糖產(chǎn)品，如低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）和低聚果糖（fructo oligosaccharide，F(xiàn)OS）已被引入嬰兒配方乳粉中，然而它們與HMOs結(jié)構(gòu)不同[4]。相比嬰幼兒配方乳粉喂養(yǎng)，母乳喂養(yǎng)嬰幼兒的消化不良、便秘、過(guò)敏和炎癥等問(wèn)題得到顯著改善[9]。研究發(fā)現(xiàn)，母乳相比于配方乳粉含有較高含量的HMOs。這些HMOs不被消化，可直接到達(dá)腸道并被腸道內(nèi)有益菌（雙歧桿菌和乳桿菌）選擇性利用，進(jìn)而改善腸道健康[10]。大量文獻(xiàn)報(bào)道了HMOs能夠改善嬰幼兒的腸道環(huán)境，促進(jìn)益生菌增殖，抑制致病菌的生長(zhǎng)，減少嬰幼兒便秘和胃腸炎的發(fā)生，減輕嬰幼兒的過(guò)敏癥狀等[11-13]。而且研究報(bào)道HMOs添加到嬰兒配方乳粉中是安全的，且耐受性良好，含有HMOs嬰兒配方乳粉的功效更接近母乳[14]。因此對(duì)HMOs組分進(jìn)行深入研究，對(duì)于優(yōu)化和改進(jìn)嬰幼兒配方乳粉，更好模擬母乳功能具有重要意義。國(guó)內(nèi)HMOs研究相對(duì)落后，對(duì)母乳內(nèi)復(fù)雜的HMOs進(jìn)行全面分析的研究還較少，現(xiàn)有研究還無(wú)法為我國(guó)母乳研究提供較確切且全面的HMOs數(shù)據(jù)。本研究主要分析HMOs含量和種類，并探究單類HMOs對(duì)益生菌的影響，為HMOs研究及開(kāi)發(fā)適合我國(guó)嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)的配方乳粉產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集中國(guó)健康、營(yíng)養(yǎng)良好的足月兒母親成熟乳20 份，同時(shí)簽署知情同意書。隨機(jī)取10 份混合，共得到2 個(gè)混合樣（混合樣1、2）。

MRS培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；不含碳水化合物來(lái)源的半自制MRS培養(yǎng)基（含1%細(xì)菌蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.2%磷酸鉀、0.5%乙酸鈉、0.2%檸檬酸鈉、0.02%硫酸鎂、0.005%硫酸錳、0.1%吐溫-80、0.003%溴甲酚紅紫）、雙歧桿菌Bb-12、發(fā)酵乳桿菌CECT5716 杜邦中國(guó)集團(tuán)有限公司；HMOs標(biāo)品（色譜純） 英國(guó)Carbosynth公司；2’-FL（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；FOS和GOS（FOS、GOS比例1∶9）（分析純） 保齡寶生物股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A35厭氧培養(yǎng)箱 英國(guó)Don Whitley Scientific公司；ICS-5000離子色譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；TE612-L電子天平 德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 母乳中HMOs組成和含量測(cè)定

取1 mL母乳與1 mL無(wú)水乙醇混合均勻并密封，于4 ℃冰箱放置60 min，取出于4 ℃冷凍離心機(jī)10 000 r/min離心20 min；取所有上清液，氮吹除去乙醇，再用甲醇溶液定容至50 mL容量瓶，樣液經(jīng)0.22 μm親水膜過(guò)濾后進(jìn)樣，采用離子色譜儀進(jìn)行HMOs組分檢測(cè)，并以HMOs標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，外標(biāo)法定量分析母乳樣品HMOs組分含量[15]。

1.3.2 HMOs對(duì)益生菌增殖的影響

為研究H M O s對(duì)雙歧桿菌B b-1 2和發(fā)酵乳桿菌CECT5716生長(zhǎng)的影響，將2 種菌株分別接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃孵育36 h后分別取100 μL至不含碳水化合物來(lái)源的半自制MRS培養(yǎng)基。添加碳水化合物（4 個(gè)組別：2 g/100 mL 2’-FL、1 g/100 mL 2’-FL＋1 g/100 mL FOS和GOS、2 g/100 mL FOS和GOS、空白對(duì)照）。每種菌株在添加不同碳水化合物的半合成培養(yǎng)基（10 mL）中培養(yǎng)，每組3 個(gè)平行樣，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。采用分光光度計(jì)每隔8 h在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（optical density，OD），記錄OD600nm[16-17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 我國(guó)母乳HMOs組成特點(diǎn)

由表1可知，2 個(gè)混合樣本的母乳HMOs含量分別為10.613、5.093 g/L，與文獻(xiàn)報(bào)道的母乳HMOs含量一般為5～15 g/L[18]相一致。2 個(gè)混合樣本總HMOs含量差異很大，說(shuō)明HMOs在不同個(gè)體母乳中的含量存在很大差異。母乳HMOs種類和含量主要受乳母的先天性差異、孕齡及哺乳期的影響[19-21]。研究表明，母乳中HMOs的先天差異可以通過(guò)乳母的分泌狀態(tài)來(lái)解釋，如1,2-巖藻基HMOs在分泌型母乳中大量存在，而在非分泌型母乳中則基本不存在[19]。1,3/1,4-巖藻基HMOs含量在非分泌型母乳中較高，而在分泌型母乳中較低[20]。正常情況下，分泌型和非分泌型母乳中HMOs的差異主要為分泌型母乳中中性HMOs含量較高。從單個(gè)種類的HMOs可以看出，受個(gè)體母乳影響的HMOs種類主要有2’-FL、3’-FL、LNFPⅠ、LNDFHⅠ和6’-SL。2 個(gè)混合母乳樣本中中性HMOs含量遠(yuǎn)高于唾液酸化HMOs，中性HMOs分別占2 個(gè)混合母乳樣本總HMOs含量的74.1%和90.3%。大量文獻(xiàn)報(bào)道2’-FL是分泌型母乳中最主要的HMOs，2’-FL和LNFPⅠ在分泌型母乳中大量存在[21-24]。本研究2 個(gè)混合母乳樣本中，混合樣2中最主要的HMOs有2’-FL、3’-FL、LNT、LNFPⅡ等，2 個(gè)混合樣中含量最多的都是3’-FL，說(shuō)明收集的母乳中有一部分是非分泌型母乳。

表 1 足月兒母親成熟乳HMOs組成（n＝10）Table 1 HMOs composition of mature breast milk of mothers of term newborns (n= 10)g/L

2.2 不同國(guó)家母乳HMOs對(duì)比

HMOs主要分為中性巖藻糖基化、中性非巖藻糖基化和酸性唾液酸化HMOs。將本研究的國(guó)內(nèi)母乳和不同國(guó)家報(bào)道的母乳中上述3 類主要HMOs占比進(jìn)行分析和對(duì)比[24-27]。不同國(guó)家母乳HMOs總含量不同，受較多因素，如哺乳期、胎齡、分泌狀態(tài)和產(chǎn)婦狀況等影響，但3 類HMOs含量占比較相似。

母乳中HMOs占比最高的種類為中性巖藻糖基化HMOs，平均占比均為60%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于唾液酸化HMOs和中性非巖藻糖基化HMOs。而不同國(guó)家母乳中唾液酸化HMOs和中性非巖藻糖基化HMOs在母乳總HMOs中占比相差較大。本研究母乳中唾液酸基化HMOs占比高于中性非巖藻糖基化HMOs，這和其他國(guó)家有差異。這種差異的發(fā)生除了樣品收集方法和分析方法可能導(dǎo)致的差異外，還有可能與不同地區(qū)和國(guó)家膳食差異有關(guān)。

2.3 HMOs對(duì)雙歧桿菌Bb-12和發(fā)酵乳桿菌CECT5716的增殖作用

HMOs對(duì)嬰兒的健康有較多有益影響，如改善腸道微生物健康、大腦發(fā)育、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和包括腎臟和肝臟在內(nèi)的器官功能[28-29]。嬰兒腸道的微生物組成和多樣性從出生開(kāi)始持續(xù)到出生后的前2～3 年，對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)和發(fā)育極為重要[27]。HMOs對(duì)改善嬰幼兒腸道微生物菌群分布具有重要作用[30-31]。本研究采用2 種常見(jiàn)的益生菌（雙歧桿菌Bb-12和發(fā)酵乳桿菌CECT5716）驗(yàn)證單種HMOs對(duì)益生菌的增殖效果。

圖 1 HMOs對(duì)雙歧桿菌Bb-12的增殖效果Fig. 1 Effect of HMOs on the proliferation of Bifidobacterium bifidum Bb-12

由圖1可知，相比空白組，添加2’-FL組的雙歧桿菌Bb-12明顯得到一定的增殖，說(shuō)明雙歧桿菌Bb-12可以利用HMOs來(lái)生長(zhǎng)。但與FOS和GOS組相比，HMOs組對(duì)雙歧桿菌Bb-12的增殖效果明顯較弱，這可能和FOS和GOS中含有一定含量的單糖或雙糖有關(guān)。FOS和FOS對(duì)益生菌的增殖效果很可能是由于其中所含的葡萄糖。HMOs目前和潛在的應(yīng)用主要集中在嬰兒營(yíng)養(yǎng)方面，2’-FL對(duì)雙歧桿菌Bb-12的增殖作用說(shuō)明HMOs的有益健康價(jià)值不局限于嬰兒。研究表明，2’-FL和LNnT大在齡兒童和成人中具有相似的安全性和耐受性，能顯著改善他們的腸道菌群結(jié)構(gòu)[32]。HMOs對(duì)一些益生菌的增殖效果并不是直接利用HMOs產(chǎn)生的，而是由其他微生物代謝HMOs產(chǎn)生的低聚糖代謝物間接影響益生菌生長(zhǎng)和增殖[33]。正是這些不同微生物和HMOs之間的直接或間接相互作用促進(jìn)人體的腸道健康。

圖 2 HMOs對(duì)發(fā)酵乳桿菌CECT5716的增殖效果Fig. 2 Effect of HMOs on the proliferation of Lactobacillus fermentum CECT5716

由圖2可知，相比空白組，添加2’-FL組的發(fā)酵乳桿菌CECT5716同樣也明顯得到一定的增殖，說(shuō)明2’-FL能被發(fā)酵乳桿菌CECT5716利用。發(fā)酵乳桿菌CECT5716于2016年新列入《可用于嬰兒食品的菌種名單》，是分離自健康母乳的有益菌種，可用于嬰幼兒配方乳粉。HMOs對(duì)發(fā)酵乳桿菌CECT5716增殖的作用說(shuō)明嬰幼兒配方乳粉中若同時(shí)添加HMOs和發(fā)酵乳桿菌CECT5716，可實(shí)現(xiàn)改善腸道健康的協(xié)同作用。同樣，F(xiàn)OS和GOS的增殖效果可能是含有一定量葡萄糖的原因。大量研究表明，含F(xiàn)OS或GOS的嬰兒配方乳粉能促進(jìn)嬰兒腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖[34-36]。因此可通過(guò)添加GOS和FOS等成分來(lái)模擬HMOs，但它們不是HMOs，并不能完全替代HMOs的功能。

3 結(jié) 論

HMOs的研究是當(dāng)今母乳和新生兒營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)。過(guò)去的幾十年，母乳成分和嬰兒營(yíng)養(yǎng)需求方面的研究取得了很大發(fā)展。補(bǔ)充HMOs對(duì)不能母乳喂養(yǎng)的新生兒是一個(gè)有吸引力的選擇。本研究對(duì)HMOs組成進(jìn)行檢測(cè)和分析，為避免單個(gè)母乳樣本差異性帶來(lái)的影響，將不同乳母的母乳樣本進(jìn)行混合。2 個(gè)混合樣本的HMOs含量分別為10.613、5.093 g/L，差異依然很大，說(shuō)明不同乳母來(lái)源的母乳HMOs差異受諸多因素影響，但含量一般為5～15 g/L。同時(shí)研究母乳中主要的HMOs之一2’-FL對(duì)常見(jiàn)益生菌的增殖效果。結(jié)果表明，2’-FL對(duì)發(fā)酵乳桿菌CECT5716和雙歧桿菌Bb-12都有一定的增殖效果，說(shuō)明一些益生菌可以利用HMOs進(jìn)行生長(zhǎng)和增殖，盡管FOS和GOS也有一定增殖效果，且已經(jīng)應(yīng)用在嬰幼兒配方乳粉中，但它們不是HMOs，并不能完全替代HMOs的功能。未來(lái)的研究應(yīng)該建立樣本量較大的我國(guó)HMOs大數(shù)據(jù)庫(kù)，并充分分析各種因素對(duì)HMOs的影響，為實(shí)現(xiàn)母嬰的個(gè)體化營(yíng)養(yǎng)提供參考。同時(shí)隨著分析分離技術(shù)和合成水平的提升，研究母乳中不同單種HMOs的功能特點(diǎn)，如2’-FL、3’-FL、LNFPⅠ、LNDFHⅠ和6’-SL等對(duì)各種腸道菌的影響。盡管在過(guò)去幾年研究獲得較大突破，特別是對(duì)于HMOs的安全性和功能，但實(shí)現(xiàn)各種HMOs在食品中的應(yīng)用仍有許多關(guān)鍵問(wèn)題需要解決，如HMOs的選擇和組合依據(jù)、每日所需量等。我國(guó)母乳研究領(lǐng)域HMOs數(shù)據(jù)有限，有必要提供新的和全面的數(shù)據(jù)，更深刻地認(rèn)識(shí)中國(guó)母乳的特點(diǎn)及其對(duì)嬰幼兒健康的影響。