高效液相色譜法測定干酪和煉乳中糠醛類化合物含量

邢倩倩

（1.乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海 200436；2.江南大學食品營養與安全協同創新中心，江蘇 無錫 214122）

干酪是牛乳經凝乳并排出部分乳清而制成的新鮮或發酵成熟的產品，包括天然干酪和再制干酪兩大類。干酪制備方法為：首先在凝乳酶或其他適當的凝乳劑作用下，使乳中1 種或幾種原料的蛋白質凝固或部分凝固，排出凝塊中的部分乳清；然后通過乳和（或）乳制品中蛋白質的凝固過程得到成品[1]。再制干酪起源于20世紀初期，通過使用1 種或2 種不同成熟度的天然干酪為主要原料，經切碎后添加乳化劑、穩定劑，融化制成。與天然干酪相比，再制干酪具有更高可融性、更長保質期及更低的貯藏條件要求等優勢[2-3]。

煉乳主要包括淡煉乳、加糖煉乳和調制煉乳三大類，是以生乳或乳制品為原料，添加或不添加食品添加劑和營養強化劑，經加工制成的黏稠狀產品。煉乳便于貯藏，營養價值高。煉乳生產工藝包括預熱消毒、加糖、濃縮、冷卻、加穩定劑、殺菌、密封[4-5]。

綜上所述，干酪和煉乳均是以牛乳為主要原料，通過添加一些常用輔料，結合不同工藝所制得。添加不同輔料的牛乳熱加工過程中，隨著熱處理溫度的升高，乳清蛋白變性和凝集、乳糖異構化和降解、美拉德反應等理化反應會依次發生，會導致其中活性成分（如堿性磷酸酶和乳鐵蛋白等）減少及化學反應產物（如乳果糖、糠氨酸和糠醛等）增加[6-12]。

美拉德反應又稱“非酶褐變反應”，是在熱（尤其是高溫）加工富含還原糖食物過程中發生的一種反應[13-17]。美拉德反應在低溫干燥和低溫高濕的食品體系中反應速率緩慢，在高于35 ℃的中等濕度條件下，美拉德反應成為主要反應[18]。在乳制品熱加工過程中，美拉德反應降低了鍵合到乳糖上的賴氨酸的可用性，進而導致了營養價值降低[19-20]。糠醛為美拉德反應中間階段色素形成過程的產物。乳制品熱加工過程中產生的糠醛類物質包含羥甲基糠醛、糠醛、呋喃甲基酮和甲基糠醛，結構如圖1所示[21]。

圖 1 乳制品中4 種糠醛類化合物結構式[21]Fig. 1 Chemical structure of four furfural compounds in dairy products[21]

在糠醛類化合物的藥理研究方面，已有體外研究表明糠醛類物質具有遺傳毒性、致突變和致癌等毒性[22-25]。歐盟食品安全委員會建議每人每天攝入的羥甲基糠醛含量上限為1.6 mg。近些年，在乳制品中的糠醛類化合物研究方面，Xing Qianqian等[26]建立高效液相色譜方法檢測液態乳中的糠醛類化合物，曹慶等[27]研究不同貯藏條件下超高溫滅菌咖啡牛乳中糠醛類化合物含量變化。現有的乳制品中糠醛類化合物含量檢測的研究主要針對液態乳制品和乳粉[13,28-29]。

由于干酪和煉乳的配料和加工工藝均會促進糠醛類化合物的生成，針對再制干酪和煉乳中的糠醛類化合物的研究還很少。本研究針對干酪和煉乳中糠醛類化合物的提取方法開展研究，在建立合適的提取方法基礎上對市面上常見品牌干酪和煉乳中的糠醛類化合物進行定量檢測，對比不同干酪和不同煉乳中糠醛類化合物的含量，并對干酪、煉乳與常規液態乳制品中所含糠醛類化合物含量進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌再制干酪A、某品牌再制干酪B、某品牌干酪C、某品牌干酪D、某品牌再制干酪E、某品牌再制干酪F、某品牌加糖煉乳A、某品牌加糖煉乳B、某品牌加糖煉乳C、某品牌淡煉乳D、巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳、低溫酸乳、常溫酸乳和褐變酸乳 上海某超市。

草酸二水合物（純度99.5%～102.5%）、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純） 德國默克股份兩合公司；三氯乙酸（純度≥99.0%） 國藥集團化學試劑有限公司；糠醛類化合物標準品：5-羥甲基糠醛（純度98%）、2-糠醛（純度99.5%）、2-呋喃甲基酮（純度95.5%）和5-甲基糠醛（純度99.6%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

PL2002電子天平、AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SK5210HP超聲清洗儀 上海科導超聲儀器有限公司；DK-8B電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司；ZWY-2102C恒溫培養振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司；Beckman Avanti J-30I落地式離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；1200高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；Milli-Q超純水儀 默克化工技術（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取干酪，分別選取0.05、0.10、0.50 g 3 種稱樣量，加入12 mL超純水，超聲30 min后振蕩20 min。

稱取煉乳，分別選取0.02、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 g 7 種稱樣量，加入12 mL超純水，超聲30 min后振蕩20 min。

稱取巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳、低溫酸乳、常溫酸乳和褐變酸乳15.00 g左右。

后續統一處理步驟為：加入5 mL當日配制0.15 mol/L草酸，100 ℃水浴加熱25 min，冷卻至室溫；加入5 mL 40 g/100 mL三氯乙酸溶液，振蕩10 min后，6 000 r/min離心15 min；取上清液倒入25 mL容量瓶，剩余固體加入5 mL 4 g/100 mL三氯乙酸溶液，振蕩10 min后，6 000 r/min離心15 min；合并上清液，加入4 g/100 mL三氯乙酸溶液定容至刻度。然后量取適量上述樣品溶液，過0.45 μm無機濾膜，進高效液相色譜儀分析。

1.3.2 高效液相色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3柱（3.0 mm×15 cm，3 μm）；流動相：流動相A為超純水，流動相B為乙腈；梯度洗脫程序：0～18.0 min、5%～65%流動相B，18.0～20.0 min、65%～95%流動相B，20.0～22.0 min、95%流動相B，22.0～22.1 min、95%～5%流動相B，22.1～30.0 min、5%流動相B；流速0.6 mL/min；色譜柱溫度30 ℃；進樣量5 μL；進樣盤溫度4 ℃；紫外檢測波長280 nm。

結果計算及方法學參數測定結果參考文獻[26]。

本研究干酪和煉乳樣品中均檢測到羥甲基糠醛和糠醛2 種糠醛類化合物，均未檢測到呋喃甲基酮和甲基糠醛，因此本研究主要針對羥甲基糠醛和糠醛進行測定。

2 結果與分析

2.1 干酪中糠醛類化合物提取方法優化

表 1 不同稱樣量前處理后干酪A、B、C、D中糠醛類化合物含量比較Table 1 Furfural compounds contents in cheese A, B, C and Ddetermined after pretreatment with different sample amounts μg/100 g

由表1可知，對比不同稱樣量所得到的羥甲基糠醛和糠醛含量，0.05 g與0.10 g稱樣量下含量類似，稱樣量少更有利于樣品分散提取，因此選定0.05 g作為干酪前處理的稱樣量[30]。

選取以上4 種干酪作為實驗對象，開展回收率實驗。選取0.05 g稱樣量，加入12 mL超純水，加入1 mL標準品混合溶液（其中羥甲基糠醛質量濃度為20 μg/mL，糠醛質量濃度為1 μg/mL），采用本研究方法測定，并計算加標回收率。

表 2 干酪A、B、C、D中糠醛類化合物的加標回收率（n=3）Table 2 Recoveries of furfural compounds spiked into cheese A, B, C and D (n= 3)%

由表2可知，加標回收率為95%～105%，RSD為0.20%～2.00%，表明該方法的回收率良好，準確性高，可作為干酪中糠醛類化合物含量測定方法。

2.2 煉乳中糠醛類化合物提取方法優化

表 3 不同稱樣量前處理后煉乳A、B中糠醛類化合物含量比較Table 3 Furfural compounds contents in condensed milk A and B determined after pretreatment with different sample amounts μg/100 g

由表3可知，對比不同稱樣量所得到的羥甲基糠醛和糠醛含量，0.02 g與0.05 g稱樣量下糠醛類化合物峰面積相近，0.05 g稱樣量下煉乳B中糠醛類化合物含量較高，因此選定0.05 g作為煉乳前處理的稱樣量[30]。

選取以上2 種煉乳作為實驗對象，開展回收率實驗。選取0.05 g稱樣量，加入12 mL超純水，加入1 mL標準品混合溶液（其中羥甲基糠醛質量濃度為20 μg/mL，糠醛質量濃度為1 μg/mL），采用本研究方法測定，并計算加標回收率。

表 4 煉乳A、B中糠醛類化合物的加標回收率（n=3）Table 4 Recoveries of furfural compounds spiked into condensed milk A and B (n= 3)%

由表4可知，加標回收率為95%～105%，RSD為0.40%～4.00%，表明該方法的回收率良好，準確性高，可作為煉乳中糠醛類化合物含量測定方法。

2.3 干酪和煉乳中糠醛類化合物含量測定結果

采用優化后的干酪和煉乳中糠醛類化合物提取方法，對市面上代表性干酪和煉乳中糠醛類化合物含量進行測定。蛋白質、糖和脂肪含量均為產品包裝上所列值。由表5可知，選擇6 種干酪進行糠醛類化合物含量測定，均檢測到羥甲基糠醛和糠醛，未檢測到呋喃甲基酮和甲基糠醛。6 種干酪中，A、B、E、F為再制干酪，C、D為干酪，4 種再制干酪中的羥甲基糠醛含量范圍為10 000～22 000 μg/100 g，遠高于2 種干酪中的羥甲基糠醛含量范圍100～400 μg/100 g，4 種再制干酪中糠醛含量范圍為75～180 μg/100 g，高于2 種干酪中的糠醛含量范圍40～70 μg/100 g。由于再制干酪是由干酪添加白砂糖和其他成分，通過加熱和持續攪拌而制成，熱加工和糖的加入都會促進美拉德反應的進行，因此4 種再制干酪中的糠醛類化合物含量均明顯高于干酪。選擇4 種煉乳進行糠醛類化合物含量測定，均檢測到羥甲基糠醛和糠醛，未檢測到呋喃甲基酮和甲基糠醛。4 種煉乳中，A、B、C為加糖煉乳，含糖量均為60%左右，D為淡煉乳，含糖量為10%。3 種加糖煉乳中羥甲基糠醛含量范圍為45 000～64 000 μg/100 g，遠高于淡煉乳D中羥甲基糠醛含量392.24 μg/100 g；3 種加糖煉乳中糠醛含量范圍為280～430 μg/100 g，高于淡煉乳D中糠醛含量77.66 μg/100 g。由于加糖煉乳中的糖含量比淡煉乳高50%，含糖量越高，美拉德反應速率越快，糠醛類化合物含量越高。

表 5 不同品類干酪和煉乳中糠醛類化合物含量Table 5 Furfural compounds contents in different brands of cheese and condensed milk

2.4 干酪和煉乳與常規乳制品中糠醛類化合物含量對比

表 6 干酪和煉乳與液態乳制品中糠醛類化合物含量比較Table 6 Furfural compounds contents in different brands of cheese,condensed milk and liquid milk products

選擇市面上代表性品牌巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳、低溫酸乳、常溫酸乳和褐變酸乳，采用本研究方法對其中的糠醛類化合物含量進行測定，并與干酪和煉乳中的糠醛類化合物含量進行對比。本方法可檢測到巴氏殺菌乳、超高溫滅菌乳、低溫酸乳、常溫酸乳和褐變酸乳中的羥甲基糠醛和糠醛，未檢測到呋喃甲基酮和甲基糠醛。

由于蛋白質是乳制品最重要的組成部分，因此以羥甲基糠醛和糠醛含量和樣品蛋白質含量計算得出樣品每克蛋白質中羥甲基糠醛和糠醛含量。由表6可知，加糖煉乳C和再制干酪E中糠醛類化合物含量較高，常溫酸乳和褐變酸乳次之，煉乳、低溫酸乳、超高溫滅菌乳和干酪中含量較低，巴氏殺菌乳最低。綜上所述，使用蛋白質含量歸一化后不同乳制品中的糠醛類化合物含量為加糖煉乳＞再制干酪＞褐變酸乳＞常溫酸乳＞煉乳＞低溫酸乳＞超高溫滅菌乳＞干酪＞巴氏殺菌乳。

3 結 論

針對干酪和煉乳中的糠醛類化合物提取方式展開研究，稱取0.05 g樣品加12 mL超純水超聲30 min，該處理方式下加標回收率均可達到95%以上。通過優化提取方法結合高效液相色譜法檢測市面上代表品牌干酪和煉乳中糠醛類化合物含量。結果表明：再制干酪A、B、E、F中的羥甲基糠醛、糠醛含量遠高于干酪C、D，4 種再制干酪A、B、E、F中的糠醛含量高于干酪C、D；3 種加糖煉乳A、B、C中的羥甲基糠醛含量遠高于淡煉乳D，3 種加糖煉乳A、B、C中的糠醛含量高于淡煉乳D。以上結果表明，干酪和煉乳中的糠醛類化合物與其相應的熱處理過程和糖含量密切相關，可通過糠醛類化合物含量區別干酪和再制干酪，區別加糖煉乳和淡煉乳。最后對干酪、煉乳與液態乳制品中每克蛋白質所含糠醛類化合物含量進行對比，結果表明，加糖煉乳＞再制干酪＞褐變酸乳＞常溫酸乳＞煉乳＞低溫酸乳＞超高溫滅菌乳＞干酪＞巴氏殺菌乳。