功能性低聚糖的研究進展及應用現狀

鄒月，黃金鳳，魏琴

(1.西華大學 食品與生物工程學院，成都 610039; 2.宜賓學院 生命科學與食品工程學院香料植物資源開發與利用四川省高校重點實驗室，四川 宜賓 644000)

1983年，日本人首次發現功能性低聚糖不能被人體消化卻能被腸道內細菌選擇性利用的特性后開啟了益生元工業化生產的道路。2009年11月1日，中國第一個與益生元產品相關的國家標準《低聚果糖》正式實施，至此我國益生元產業高速發展。隨著益生元來源及應用越來越廣，Gibson等[1]在2016年將益生元重新定義為：能夠被宿主微生物選擇性利用從而帶來健康益處的物質。雖然益生元與益生菌功能相似，都能改善腸道菌群比例，但益生菌在實際使用時需要考慮外來益生菌到達腸道時存活率和定植問題，益生元則不需要考慮這些，攝入后選擇性地促進腸道中有益微生物生長和代謝維持人體腸道菌群平衡[2-3]。目前對益生元的研究主要針對功能性低聚糖、多糖、微藻類，常將其添加到食品中開發具有獨特功能的產品。

低聚糖是由2～10個單糖分子經糖苷鍵連接而成的低度聚合糖，按照有無生理功效可分為普通低聚糖和功能性低聚糖[4]。普通低聚糖能直接被人體消化、吸收，功能性低聚糖無法被上消化道分解，通過在腸道中發揮其獨特的生理功能來維持宿主健康。一般認為功能性低聚糖能特異性地誘導腸道中雙歧桿菌生長，促進雙歧桿菌發酵產生大量短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)，并抑制有害菌生長繁殖，降低有害菌和毒素在腸膜的附著力。此外，研究人員還證明了功能性低聚糖在免疫調節、抗炎活性、促進營養物質吸收、降低膽固醇和調節腸道滲透壓等方面功能。

1 功能性低聚糖常見制備方式和研究現狀

目前除直接從天然產物中提取功能性低聚糖外，工業上主要利用單糖合成或多糖降解的手段制備功能性低聚糖。

由表1可知，常見功能性低聚糖制備方法有6種，下面主要對工業上常用的3種方式：酶合成法、微生物發酵法和酶降解法進行介紹。

表1 常見功能性低聚糖來源及制備方法Table 1 The sources and preparation methods of common functional oligosaccharides

1.1 酶合成法

酶合成法是使用糖基轉移酶對底物進行轉化，合成功能性低聚糖的方法。目前主要運用于GOS、OsLu、FOS這些已經廣泛作為食品輔料、臨床醫藥和保健品領域的益生元合成。一些常用酶制劑往往同時具有降解酶和糖基轉移酶活性。例如，將β-半乳糖苷酶加入乳糖液時，若半乳糖基的受體為水，就會發生乳糖的降解反應，釋放半乳糖和葡萄糖；如果半乳糖基的受體是乳糖，就會催化糖基供體底物中的糖殘基轉移到受體，形成新的糖苷鍵，通過一次或多次的轉移半乳糖基化，最后形成不同結構的GOS混合物[9]；菊粉酶既可將菊粉降解為FOS和菊糖低聚糖，也可以蔗糖作為底物合成FOS(蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖)。酶合成法生產功能性低聚糖分為兩步：微生物生產具有糖基轉移活性的功能性低聚糖合成酶；將純化酶加入底物中生產功能性低聚糖。不同微生物來源獲得的同種酶合成的功能性低聚糖結構有很大不同。研究人員從米曲霉β-半乳糖苷酶產生以Gal-β(1→6)-Gal-β(1→4)-Glc為主的9種混合GOS化合物[10];從芽孢桿菌突變β-半乳糖苷酶合成的GOS混合物中鑒定出14種新的GOS化合物。工業上為提高酶合成功能性低聚糖的產率，除優化溫度、pH、底物濃度等條件外，還利用基因工程技術修改野生酶糖苷配基位點或增強酶活性中心疏水性，得到活力高、穩定性好的突變酶。

我國工業上生產低聚果糖、低聚半乳糖時主要采用酶合成法。目前量子高科在固定化果糖基轉移酶法生產蔗果低聚糖方法基礎上，自主研發出最新的“第三代固定化果糖基轉移酶技術”生產FOS，該法所生產的FOS一次轉化率可達55%～60%。2013年該公司募投的10000 t低聚果糖擴產項目已順利投產。保齡寶生物股份有限公司建立的年產5000 t低聚半乳糖項目也于2016年順利投產。

1.2 微生物發酵法

微生物發酵法又稱為一次發酵法，是在底物中加入能將其合成為功能性低聚糖的微生物，同時獲得酶和功能性低聚糖的方法，這省去了生產和純化酶步驟，工業生產功能性低聚糖成本顯著減少。舒丹陽等在草石蠶原料中接種0.01%黑曲霉和0.01%乳桿菌的混菌發酵組合，發酵36 h，進行一系列精制純化后可得純度高達78.13%的水蘇糖。 然而微生物發酵法得到的產物中除了我們所需功能性低聚糖外還含有大量無益生作用的糖(以葡萄糖和底物為主)，這些糖不僅會抑制糖基轉移反應，降低產量，還會制約功能性低聚糖的益生效果。最近研究發現，使用功能性低聚糖產生菌和釀酒酵母共培養法生產功能性低聚糖時能顯著提高功能性低聚糖的純度。Nobre等[11]將曲霉菌，釀酒酵母YIL162W和底物加入發酵罐中在溫度30 ℃，pH 6.0的條件下反應53 h，可生產出純度高達(93.8±0.7)% (W/W)FOS混合液。然而，除日本以外，其他國家很少有完全掌握微生物發酵法產業化技術的企業，且在食品生產過程中，酶合成法較微生物發酵法更具有安全性、穩定性，因此微生物發酵法使用率較低。

1.3 酶降解法

天然多糖通常具分子量過大、粘度高、結構復雜等特點，導致其生物活性無法有效發揮，使用生物、化學和物理等手段均可使其獲得更強的生物活性。隨著可持續發展意識的增強，研究人員開始將注意力轉移到農副產品的開發利用上。農副產品中含有大量具有可降解為功能性低聚糖的多糖，如蘋果渣、柑橘皮、甜菜渣中含有果膠；玉米芯、稻殼、秸稈中含有木聚糖。通過將這些廢棄物中大分子多糖降解為所需的功能性低聚糖是如今學術界和工業界的研究重點。其中XOS的雙歧因子功能是其他功能性低聚糖的10～20倍，對雙歧桿菌和青春芽孢桿菌有極強的促生效果，被認為是最有潛力的益生元。山東龍力生物科技作為國內首家實現低聚木糖工業化生產的企業，該公司使用酶法降解玉米芯，低聚木糖年產量可達4000 t左右。與化學降解法和物理降解法相比，酶降解法條件更為溫和，產物可控性強，專一性強，是通過降解多糖制備功能性低聚糖最常用的方法之一，因此研究人員常使用酶降解法降解農副產品。Hong等研究芒果木質纖維素酶解液益生作用時發現，使用疏水樹脂純化的水解液顯示出對乳酸菌較強的促生效果。Baldassarre等[12]在酶膜反應器中，利用50 g/L洋蔥皮粗果膠提取物，在溫度45 ℃、酶濃度41.4 U/mL、反應時間15 min的條件下，可獲得最高POS體積產率22.0 g/(L·h)。酶降解法能快速大量地獲得所需功能性低聚糖，具有廣闊的開發前景，然而生產中會得到大量副產物，如何降低高昂的后續分離純化成本是工業上運用此法最大的難題。

1.4 其他制備方法

除上述方法外，為探索一種快速、高效、環保的單糖合成低聚糖工藝，Liu等[13]提出快速淬火轉化法(sharp-quenching thermo conversion, SQTC)，該法將單糖放進管式反應器后升溫到最佳熱轉換溫度再經過反應初期、低聚糖形成期和活性反應后期3個階段，并以空氣或氮氣作為淬火介質，可短時間獲得40%左右的低聚糖。在研究降解天然多糖方法時，研究人員常結合多種方法制備低聚糖。例如Jian等[14]采用γ射線輻照與酶解相結合的方法將魔芋葡甘聚糖降解為魔芋低聚葡甘聚糖；朱新鋒等[15]發現使用撞擊流法可有效將較低濃度的殼聚糖降解為低聚殼聚糖。

2 功能性低聚糖生理活性研究現狀

2.1 調節腸道微生物

大量臨床研究表明，健康受試者服用功能性低聚糖后會促進腸道中雙歧桿菌生長。Endo等[16]通過糞便發酵實驗評價1-Kestose對健康人腸道微生物群的影響，16S rRNA基因測序和定量PCR檢測結果均顯示1-Kestose組長雙歧桿菌水平明顯高于對照組，大腸桿菌明顯低于對照組，這表明1-Kestose可能是通過促進益生菌繁殖和抑制致病菌生長來調節腸道健康。這可能是雙歧桿菌作為腸道優勢菌后通過種間競爭間接抑制其他微生物生長，且益生菌發酵低聚糖時產生的SCFAs導致腸道中pH下降，這也會進一步抑制某些細菌。研究人員還發現在機體患病情況下攝入低聚糖，能監測到與疾病相關的細菌繁殖受到抑制。Wang等[17]研究表明，MOS能降低與炎癥和肥胖相關的幾種細菌，如Oscillospiraspp.，Coprococcusspp.和Ruminococcusspp.的相對豐度。此外，Yang等[18]還證實GOS能修復小鼠因飲酒而導致腸道微生物群失調，消除外周血中過量的內毒素。

2.2 抗炎活性

炎癥是機體在應對外界不良刺激時發生的一種自動防御反應。通常情況下炎癥是對人體有益的，然而過激的炎癥反應會使人患上炎癥性疾病。其中炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)就是在免疫、環境、遺傳和藥物感染等因素刺激下使腸道黏膜免疫系統異常導致的發炎反應[19]。作為一種新型的生物制劑，功能性低聚糖制劑可通過調節炎癥標志物緩解IBD癥狀。Sun等[20]利用人結腸上皮細胞和脂多糖(LPS)建立結腸炎模型研究GOS對結腸炎相關的miRNAs調節作用，發現GOS預處理使miR-19b表達顯著上調，炎癥因子TNF-α、IFN-α和IL-1α釋放被抑制，LPS誘導的細胞損傷癥狀得到緩解。當miR-19b被沉默時，GOS體外和體內結腸保護作用均減弱。這表明GOS在一定程度上可以通過上調miR-19b預防結腸炎。據報道，大約50%接受化療或放療的癌癥患者會患上粘膜炎[21]，Galdino等[22]探索FOS對5-氟尿嘧啶(5-FU)所致腸黏膜炎的治療作用時發現，小鼠食用FOS后髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和嗜酸性粒細胞過氧化物酶(eosinophil peroxidase,EPO)活性均降低，表明FOS可通過減少小鼠腸膜上中性粒細胞和嗜酸性粒細胞來減輕炎癥反應。最近還發現FOS可通過降低活性氧(reactive oxygen species,ROS)產生和肝細胞凋亡來改善炎癥反應[23]。綜上，隨著人們對IBD病因和發病機制的研究逐漸深入，功能性低聚糖在治療IBD的作用機制還處于探索階段，其有效性還需通過臨床實驗進一步驗證，但將其作為治療IBD藥物的應用前景仍十分廣闊。

2.3 免疫調節

腸道不僅是人體最大的消化器官，也是人體最大的免疫系統。功能性低聚糖到達腸道后可通過促進抗體形成和細胞因子釋放來增強機體免疫功能。Genda等[24]研究食用低聚果糖的大鼠盲腸內免疫球蛋白(IgA)濃度變化機制結果顯示，短期攝入FOS(7 d或9 d)可顯著提高盲腸IgA濃度且伴隨著促炎細胞因子和多聚免疫球蛋白受體(pIgR)表達增加而升高。花生過敏者和服用免疫抑制劑的人群也可通過食用功能性低聚糖來增強免疫效應[25]。此外，由于雙歧桿菌本身具有復雜的增強機體免疫功能的能力，功能性低聚糖還可通過促進雙歧桿菌繁殖間接調節腸道內免疫活性。

2.4 促進營養物質吸收

由于功能性低聚糖的攝入，腸道中SCFAs增加，pH降低，礦物質溶解度增加，這極大地幫助了人體對礦物質的吸收，因此以GOS和FOS為主的功能性低聚糖在促進機體對鈣、鐵、鎂和無機磷等礦物質吸收的生理活性被科研人員廣泛關注。Marciano等[26]評價低聚果糖對生長期缺鐵性貧血大鼠鐵吸收調節因子的影響，發現FOS可能是通過降低十二指腸鐵蛋白表達和降低盲腸中IL-10、IL-6和TNF-a因子濃度來調節貧血大鼠鐵的吸收。Seijo等[27]研究證實，不同鏈長的GOS/FOS混合物能誘導近端結腸(吸收鈣)和遠端結腸(吸收鎂)中腸道細菌連續發酵，提高礦物質的吸收效率，通過增加骨骼礦化、密度和結構來維持骨健康。最近有報道顯示，功能性低聚糖除了能增加機體對礦物質的吸收能力外，還能通過提高對黃酮類化合物的吸收能力來增強機體的抗氧化活性[28]。

2.5 改善糖尿病癥狀及其他

Ⅱ型糖尿病作為一種中老年常見慢性病，主要與胰島素水平低或胰島素抵抗相關。目前，治療糖尿病的藥物主要有胰島素及其類似物、磺酰脲類促泌劑、二甲雙胍類等。常用藥物相關的副作用限制了它們在臨床治療中的應用，急需尋找其他副作用較少的降糖藥物。功能性低聚糖具有多種抗糖尿病作用機制，包括改善胰腺功能、抑制α-葡萄糖苷酶、減輕胰島素抵抗、抗炎作用、調節腸道微生物群和激素等，減少其他糖尿病危險因素是一種潛力極大的降糖藥物替代品。Zheng等[29]研究證實殼寡糖可通過抑制腸道α-葡萄糖苷酶和葡萄糖轉運蛋白SGLT1和GLUT2表達，逆轉胰島素抵抗來發揮抗糖尿病作用。

功能性低聚糖還具有保護腸道屏障、調節脂質代謝、護膚、緩解便秘等生理活性。例如，Wu等[30]研究FOS對腸黏膜屏障的直接影響時發現，在沒有微生物的情況下，FOS可通過激活腸上皮細胞中蛋白激酶C-δ活性直接發揮屏障保護功能；Hashmi 等[31]利用乳糖液合成的GOS喂養高膽固醇雌性大鼠，與對照組相比，GOS喂養大鼠的血清甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白膽固醇顯著降低。此外，GOS還被證實具有增強皮膚保濕和抑制黑色素積累的能力[32]，可作為護膚品的天然替代品應用。

3 功能性低聚糖應用現狀

3.1 在食品領域的應用

隨著消費者對食品安全及功能的要求升級，益生元及其制品的開發應用一直是食品行業的研究熱點。目前，世界上益生元食品的研發和應用由幾個龍頭企業領頭，如日本的Meijika Kaisha、比利時的Beneo-Orafti、荷蘭的Friesland Campina和中國的量子高科等。功能性低聚糖作為一種甜度較低、溶解度高的碳水化合物益生元，研究人員將其加入發酵乳制品、飲料、保健品、烘培等食品中開發具有一定功能的食品。由于不同功能性低聚糖在結構、組成、性能上有差異，導致不同功能性低聚糖對益生菌的促生能力有所不同。Li等[33]使用乳酸桿菌評估10種常用于人類飲食中商業益生元的益生活力。結果顯示，以在葡萄糖上生長的菌株作為對照，僅乳糖醇、GOS和FOS能促進菌株生長，在其余益生元上菌株生長受到抑制。而Delgado-Fernandez等[34]在制作合生發酵乳時發現，由于原料乳中本身含有乳糖，功能性低聚糖并不會參與發酵乳的發酵和貯藏過程，反而能將其作為食品基質到達遠端結腸，改善腸道微生物組成。在食品中功能性低聚糖除作為雙歧因子存在外，功能性低聚糖還能作為食品添加劑加入食品中改善食品的質構、熱量和風味。例如，FOS既能作為蔗糖替代品賦予食物甜味，還能作為脂肪替代品生產低熱量食品，在干酪中加入FOS能生產出結構更緊密的奶酪[35]。此外，因功能性低聚糖具有抗菌性和抗氧化活性，研究人員還將其制成可食性涂膜應用于水果的儲藏保鮮中。

表2 部分商業化功能性低聚糖食品Table 2 Some commercial functional oligosaccharide food

3.2 在飼料領域的應用

抗生素作為一類在低濃度下就對病原微生物具有抑制或殺滅的重要藥物，曾廣泛應用于畜禽飼料生產中。然而長期、大劑量攝入抗生素會導致畜禽免疫力下降，還能讓病原菌產生耐藥性，養成超級細菌，甚至嚴重的藥物殘留還會威脅到人體健康。近些年來，許多國家都開始限制甚至禁止抗生素在動物飼料中的使用，我國農業農村部也要求，2020年豬飼料中將全面禁止添加抗生素。功能性低聚糖作為部分抗生素替代品開始被加入魚類、仔豬、肉雞等動物日糧中進行相關研究。研究人員通過對比仔豬食用添加250 mg/kg抗生素(100 mg/kg硫酸粘桿菌素、100 mg/kg喹乙醇和50 mg/kg北他霉素)或800 mg/kg奇力素TM(富含甘露聚糖)飼料28 d的效果，發現與抗生素組相比，添加奇力素TM對腹瀉和死亡率的影響與抗生素相似，且豬腸道形態更健康[36]。Lu等[37]首次對草魚食用添加甘露寡糖飼料的效果進行研究，結果表明，飼料中添加適量MOS(200～600 mg/kg)可以改善草魚的生長性能，保護腸道結構的完整性，從而促進腸道健康(腸道生長、腸道菌群和SCFAs)，增強抗氧化能力。為充分發揮功能性低聚糖的效果，研究人員還將功能性低聚糖與益生菌混合制成合生飼料，也有人將其與揮發性精油混合來調節肉雞和牛犢的生長性能[38]；在市面上售有名為“功能性低聚糖863”的混合型飼料添加劑，以XOS、低聚麥芽糖、甘露寡糖為主要成分，適用于魚類、蝦類、貝類等海淡水養殖動物，具有調節腸道細菌平衡，預防細菌病毒疾病發生，促進營養轉換等功效。盡管功能性低聚糖作為一種飼料添加劑能使動物保持健康，促進生長，但還不清楚功能性低聚糖對腸胃中具體哪些微生物造成了影響，發生了哪些代謝反應，需要使用分子生物學技術解釋這些復雜的關系才能更加準確地將功能性低聚糖應用于飼料行業中。

3.3 在農業中的應用

研究人員常將功能性低聚糖作為外源誘導子，刺激農作物在遇到病原體入侵或害蟲啃食時啟動防御反應。Ma等[39]利用蛋白組學技術評價了COS對尖孢鐮刀菌引起的水稻幼苗枯萎病的影響。結果表明，COS可通過刺激水稻根部二萜類化合物生物合成途徑中差異蛋白的表達，促使相關酶活性提高和抗菌物質稻殼酮積累，尖孢鐮刀菌對水稻根系生長的抑制作用得到緩解。Li等[40]施用50 μg/mL濃度的COS用于茶樹葉片上，可誘導茶樹對炭疽病的抗病性。與傳統化學農藥相比，功能性低聚糖具有安全、無毒和環境友好等特點，在保護農作物的同時還能解決農藥殘留和害蟲抗藥性等問題，是一種理想的生物農藥候選物。近年來國內生物農藥技術的研發獲得重大突破，以殼寡糖為代表的功能性低聚糖農業產品逐年增多，如江西正邦作物、青島博智匯力、山東海龍元等公司均推出以農業級殼寡糖為有效成分具有抑制病原菌，提高抗逆性，改善作物品質等功能的生物農藥，湖北維納施生態工程有限公司推出為促進作物光合作用，廣譜抑菌的殼寡糖復合肥料17-7-27-維納施。作為一個人口和農業大國，生態環保型農藥、肥料的市場潛力極大，開發利用功能性低聚糖，以生物方法解決農業中遇到的問題一直是我國學者和生物公司研究的熱點。

4 展望

隨著功能性低聚糖在腸道微生態中生理功能研究加深，功能性低聚糖在食品、飼料和農藥等領域需求量逐漸增大。現階段高純度功能性低聚糖生產成本高，產率低，急需從以下幾個方面提升和發展。第一，篩選、誘變功能性低聚糖生產菌。微生物合成法是工業上生產功能性低聚糖的常用方法，產率不高和產物高度非均質性是目前、的主要困難。使用基因工程技術針對性地對野生菌進行誘變后通過篩選得到高產菌，可能是解決這些問題的最優手段。第二，提高工業生產自動化程度。穩定性和可重復使用性是目前工業生產功能性低聚糖的基本要求。結合宏觀動力學模型和固定化酶重復間歇操作可以全局和局部地對生產實現最優控制，是未來工業化生產功能性低聚糖的方向。第三，探究多糖水解方法。解決天然多糖降解物復雜，純化和結構鑒定困難這些問題也是目前研究的熱點[41]。第四，純化方法研究。純度過低的功能性低聚糖會直接削弱其生理活性發揮。目前工業上常用膜分離技術、微生物處理、模擬移動床、吸附法等純化技術進行純化，這些純化技術可使得部分低聚糖純度為95%以上，但隨著純度的增高，對廠家生產技術和設備的要求相應提高，國際上僅日本和中國擁有幾家能規模化生產高純度功能性低聚糖的廠家。

為了幫助功能性低聚糖在食品、飼料、農業等領域更好應用，一方面需要盡快形成一套完整的功能性低聚糖安全性評價體系。另一方面，對現有功能性低聚糖結構特性進行表征，包括聚合度、糖苷鍵類型、單糖譜等，建立結構與功能之間的關系，使產品標準化，這樣才能使商業化的功能性低聚糖產品產生更多收益。