Cx43介導(dǎo)GJIC與mTOR在胃癌組織中表達(dá)及意義

劉 歡， 趙 楊， 申興斌， 劉莎莎

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科， 河北 承德 067000)

在我國(guó)，胃癌的發(fā)病率及死亡率排名第二位，以中老年男性多見[1]。臨床上胃癌以中晚期患者多見，傳統(tǒng)治療以手術(shù)治療為主，化療藥物為輔，多種靶向藥物治療胃癌處于臨床試驗(yàn)中，但治療效果有待提高，因此研究胃癌潛在的治療靶點(diǎn)尤為重要[2]。連接蛋白43(Connexin43，Cx43)是細(xì)胞間隙連接(gap junction intercellular communication，GJIC)的重要組成連接蛋白之一，Cx43介導(dǎo)的GJIC廣泛存在于正常細(xì)胞膜上，是連接細(xì)胞與細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)跨膜通道。其組成的通道使<1000kDa分子通過，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、分化，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境等。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin mTOR)是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的重要下游蛋白分子，處于整個(gè)信號(hào)通路的中心位置，影響下游p70或4E-BP1的轉(zhuǎn)錄。參與基因轉(zhuǎn)錄翻譯、核糖體生成及細(xì)胞凋亡等過程，在腫瘤增殖和侵襲中起重要作用[3,4]。在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Cx43與mTOR的表達(dá)情況是否存在一定的關(guān)聯(lián)尚未見報(bào)道，值得進(jìn)一步探討。本研究通過運(yùn)用免疫組化和qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)Cx43及mTOR蛋白和mRNA的表達(dá)情況，探討其與胃癌病理特征參數(shù)的相關(guān)性，探索胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，為尋找潛在治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料:收集2019年2月至9月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)根治性手術(shù)切除的新鮮胃癌患者標(biāo)本60例，術(shù)前均未行放化療及免疫治療，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為胃腺癌。留取胃癌組織及正常胃黏膜組織(距癌灶至少5cm以上)，一部分新鮮組織立刻放置-80℃超低溫冰箱保存用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，另一部分組織制成蠟塊切片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。60例胃癌患者中男性53例，女性7例，年齡在39～85歲，<60歲28例，≥60歲32例；高中分化15例，低分化45例；TNM分期(根據(jù)AJCC/UICC胃癌TNM分期第八版)I～I(xiàn)I期21例，III～I(xiàn)V期39例；無淋巴轉(zhuǎn)移25例，有淋巴轉(zhuǎn)移35例；≤深肌層9例，>深肌層51例。

1.2免疫組化

1.2.1方法:所有標(biāo)本固定后，常規(guī)脫水、包埋，5μm切片，烘烤，常規(guī)脫蠟復(fù)水，抗原修復(fù)，去酶，封閉，滴加Cx43(抗體濃度為1∶150)、mTOR(抗體濃度為1∶150)及PBS做陰性對(duì)照，二抗IgG，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色。

1.2.2判讀標(biāo)準(zhǔn):Cx43、mTOR抗體表達(dá)陽性著色分布于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(×400)，采用雙盲法按陽性細(xì)胞百分比(A值)及染色強(qiáng)度(B值)進(jìn)行評(píng)分。A值：陽性細(xì)胞所占平均百分比評(píng)分：≤5%記0分；>5%～25%記1分；>25%～50%記2分；>50%記3分。B值：染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色記0分；淡黃色記1分；黃色記2分；棕黃色記3分。A+B為總分：總分0分為陰性(-)；1～2分為弱陽性(+)；3～4分為中等陽性(++)；5～6分為強(qiáng)陽性(+++)。以-～+為低表達(dá)(陰性)，++～+++為高表達(dá)(陽性)。

1.3qRT-PCR

1.3.1方法:①取上清液：取20mg新鮮胃癌組織及正常胃黏膜組織，用500ul Buffer RL1將組織勻漿，收集上清液，并用DNA-cleaning column去除DNA，離心13,400×g，2min(收集濾液，轉(zhuǎn)移至新離心管中)。②調(diào)整上柱體系：每500ul濾液內(nèi)添加800uL Buffer RL2，用RNA-only Column 特異性吸附RNA，離心13,400×g ，1min。③洗滌：用500uL Buffer RW1 去蛋白(13,400×g ，1min)，再用700uL Buffer RW2 洗滌2次脫鹽，(13,400×g ，1min)。④離心：去除殘留乙醇13,400×g ，2min。⑤洗脫提取RNA：50ulRNase-Free ddH2O 13,400×g ，1min。⑥按反轉(zhuǎn)試劑盒說明在200ul無酶EP管內(nèi)構(gòu)建20μl反轉(zhuǎn)體系5×ABScript II RT Mix 4uL ，總RNA 1pg-1ug，Nuclease-free H2O補(bǔ)足至 20μL；溫度設(shè)置：25℃ 5min→42℃ 15min→85℃ 5sec→12℃ Hold。⑦擴(kuò)增：2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mi 10uL，上下游引物2ul，cDNA模板2ul，RNase Free dH2O 6ul，共20uL反應(yīng)體系；反應(yīng)溫度設(shè)置：95℃ 3min，1 cycle→95℃ 5 s+60℃ 30 s，40 cycles。

1.3.2結(jié)果:實(shí)驗(yàn)得到的Ct值，以2-ΔΔCt來表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1Cx43及mTOR在胃癌組織及正常胃黏膜組織中蛋白及mRNA表達(dá)比較。

2.1.1免疫組化顯示：Cx43及mTOR蛋白的陽性表達(dá)在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中(見圖1，圖2)。Cx43蛋白在胃癌組織中陽性表達(dá)率(41.7%，25/60)明顯低于正常胃黏膜組織(86.7%，52/60)(P<0.01)，見表1，mTOR蛋白陽性表達(dá)率(83.3%，50/60)則明顯高于正常胃黏膜組織(43.3%，26/60)(P<0.01)，見表1。

表1 免疫組化Cx43及mTOR在不同胃組織中蛋白表達(dá)比較

圖1 Cx43在胃癌和正常胃黏膜組織中的表達(dá)

圖2 mTOR在胃癌和正常黏膜組織中的表達(dá)

2.1.2qRT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示：Cx43在胃癌組織中mRNA表達(dá)量(0.57±0.11)低于正常胃黏膜組織中mRNA表達(dá)量(1.00±0.00)；mTOR在胃癌組織中mRNA表達(dá)量(1.87±0.28)高于正常胃黏膜組織中mRNA表達(dá)量(1.00±0.00)(均P<0.01)，見圖3。

圖3 Cx43及mTOR在胃癌組織和正常胃黏膜組織中mRNA 的表達(dá)

2.2 在胃癌組織中Cx43、mTOR蛋白和mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系:在惡性程度為高中分化，TNM分期為I和II期，浸潤(rùn)未超過深肌層及無淋巴轉(zhuǎn)移及的胃癌組織中Cx43蛋白表達(dá)量比惡性程度為低分化，TNM分期為III和IV期，浸潤(rùn)超過深肌層及伴淋巴轉(zhuǎn)移的胃癌組織高；在惡性程度為高中分化，TNM分期為I和II期，浸潤(rùn)未超過深肌層胃癌組織中mTOR蛋白表達(dá)量比惡性程度為低分化，TNM分期為III和IV期，浸潤(rùn)超過深肌層的胃癌組織低；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 Cx43及mTOR蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Cx43 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在TNM分期為I和II期(0.67±0.05)比III和IV期(0.52±0.09)高，浸潤(rùn)未超過深肌層(0.64±0.06)比浸潤(rùn)超過深肌層(0.56±0.11)高，無淋巴轉(zhuǎn)移(0.64±0.07)比伴淋巴轉(zhuǎn)移(0.53±0.10)高，高中分化(0.63±0.08)比低分化(0.55±0.11)高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。胃癌組織mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)量則與之相反，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表3。

表3 Cx43及mTOR mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

GJIC是連接細(xì)胞間的信息傳導(dǎo)的特殊膜結(jié)構(gòu)，目前發(fā)現(xiàn)組成GJIC的連接蛋白(Connexin，Cx)有21種，但Cx43介導(dǎo)的GJIC與腫瘤關(guān)系最為密切，研究熱點(diǎn)也圍繞于此。Cx43在正常組織中廣泛表達(dá)在細(xì)胞膜上[5]。本研究發(fā)現(xiàn)Cx43在正常胃黏膜細(xì)胞膜表面廣泛表達(dá)，在胃癌組織細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)減少或缺如，表明Cx43可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，其致癌機(jī)制可能是Cx43在胃癌組織中表達(dá)減少，使Cx43介導(dǎo)的GJIC功能下降，使細(xì)胞間傳遞細(xì)胞增殖和分化的信號(hào)受阻，導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。張立偉[6]等的研究亦支持這一觀點(diǎn)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)隨著胃癌組織惡性程度的增加、臨床分期越晚、浸潤(rùn)程度越深及淋巴轉(zhuǎn)移，Cx43表達(dá)逐漸減少甚至缺如。同時(shí)li[7]等人在顯微鏡下觀察到Cx43介導(dǎo)的GJIC膜結(jié)構(gòu)在胃癌組織中隨著惡性程度的增加間隙連接結(jié)構(gòu)遭到破壞越嚴(yán)重。結(jié)合文獻(xiàn)[8]說明Cx43與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且參與了胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。以上結(jié)論說明Cx43作為治療胃癌的潛在靶點(diǎn)提供了有效的理論依據(jù)。

mTOR是一個(gè)長(zhǎng)度為289kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于PIKK家族成員。其下游蛋白以4E-BP1和p70S6K為最主要，mTOR介導(dǎo)的下游通路主要功能是促進(jìn)蛋白翻譯過程，加快蛋白合成。本實(shí)驗(yàn)研究顯示：在胃癌組織中mTOR表達(dá)量均比正常胃黏膜組織表達(dá)量高。隨著胃癌組織惡性程度的增高、臨床分期越晚、浸潤(rùn)深度越深，mTOR的表達(dá)量越高，結(jié)合文獻(xiàn)[9]推測(cè)mTOR在胃癌組織中過度激活，其相關(guān)信號(hào)通路則過度激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管形成、抑制細(xì)胞凋亡及自噬。以上研究結(jié)果說明mTOR在胃癌中的異常激活，參與胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制。

本研究相關(guān)性分析顯示在胃癌組織中Cx43及mTOR蛋白及mRNA表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。所以我們推測(cè)可能在基因水平Cx43的表達(dá)下降，使Cx43蛋白表達(dá)下降導(dǎo)致Cx介導(dǎo)的GJIC功能抑制或缺陷，從而使細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)功能減弱，可能使細(xì)胞內(nèi)mTOR mRNA翻譯活性的增強(qiáng)，使胃癌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加，抑制細(xì)胞凋亡，加快細(xì)胞周期的運(yùn)行，促進(jìn)腫瘤血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移。目前有臨床試驗(yàn)應(yīng)用抗mTOR靶向藥物治療胃癌，但胃癌晚期患者的中位生存期及腫瘤控制率未顯示出該藥物的有效性[10,11]?？赡苁且?yàn)槔着撩顾丶捌漕愃莆锿ㄟ^負(fù)反饋引起AKT過度活化，減弱了其抗腫瘤作用，限制了抗mTOR靶向藥物治療的作用，故需要研究多個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合靶向治療胃癌。總之，Cx43及mTOR在胃癌組織中存在異常表達(dá)，表示可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，兩者在胃癌的演進(jìn)過程中起拮抗作用，Cx43可能是胃癌治療潛在作用靶點(diǎn)，與mTOR靶點(diǎn)聯(lián)合治療胃癌成為可能，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。