尿miR-128a和miR-28-3p聯合檢測在前列腺癌診斷和預后中的價值

袁海川 宋武 顧朝輝 李連紅 羅程鵬 徐可

前列腺癌是常見的惡性腫瘤，在我國其發病率呈逐年增高的趨勢，并發現高雄性激素或者雌性激素受體敏感性改變著，其發病率更高，嚴重威脅患者的生命，影響患者的生活質量，因此早期診斷前列腺癌是提高和延長術后生存期的關鍵[1]。微小RNA(miR)是長度為19-25核苷酸的RNA，在真核細胞中是一類具有調節功能的非編碼RNA，其參與了腫瘤的發生發展中具有重要作用，并作為診斷和判斷預后的腫瘤標記物[2,3]。現常用的標本為組織標本，雖然準確度較高，但獲取標本為有創性，患者的依從性較差[4]。現已經證實尿液也是重要的標本庫，尤其在膀胱癌、前列腺癌和腎癌中的診斷具有優勢[5,6]。本研究通過尿液檢測miR-128a和miR-28-3p水平，觀察其在診斷前列腺癌和預測預后中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2016年12月在仁和醫院和復旦大學附屬華山醫院就診確診的前列腺癌患者尿液標本117例，為前列腺癌組。年齡45～85歲，平均年齡(62.34±10.65)歲；前列腺癌特異性抗原(PSA)≥10 ng/L 38例，<10 ng/L 79例；Gleason評分≥7分77例，<7例40例；腫瘤直徑≥3 cm 54例，<3 cm 63例。選擇同期診斷為前列腺良性增生患者的尿液標本75例，為前列腺良性增生組，其中年齡45～83歲，平均年齡(62.76±6.82)歲；選擇同期行健康體檢者尿液30例，為健康對照組，年齡45～80歲，平均年齡(62.19±7.15)歲。3組年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：均行手術治療，病理確診為前列腺癌；所有的患者術前未行放療、化療和免疫治療等；均經倫理委員會審核通過。

1.2.2 排除標準：其他臟器的惡性腫瘤；臨床資料不完整，無法進行統計分析的患者；已行放療、化療和免疫治療的患者。

1.3 方法

1.3.1 尿液標本的保存:患者入院時和前列腺癌患者術后1周后，禁飲食12 h后收集中后段尿液100 ml，放置低溫冰箱中保存，并在2 h內予以離心，離心速度3 000 r/min，時間30 min，并分裝在RNA酶處理過的Eppendorf管中，保存于-80℃的冰箱。

1.3.2 實時定量PCR：取尿液上清液用紫外光光度計分別檢測在230 nm、260 nm和280 nm處的吸收值。實驗采用Primer Premier 5.0 軟件涉及引物。miR-128a引物序列，正向5’-ACACTCCAGCTGGGTCACAG

TGAACCG-3’，反向5’- CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；miR-28-3p的引物序列，正向5’-CACCTAGCTTATCAG

ACTGATGTTGATTTTTTG-3’，反向5’-AGCTCAAAAA

ATCAACATCAGTCTGATTTTTTG-3’；U6引物序列，正向5’-ATTGGAACGATACAGAAGATT-3’，反向5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。使用20 μl的cDNA 的合成反應體系，使用PCR擴增儀，分別在26℃，42℃和85℃的溫度下，分別反應30 min，30 min和10 min。最后將引物，定量PCR Master Mix， Taq DNA 聚合酶和cDNA 模板加入ddH2O中形成20 μl的反應體系。反應過程：分別在95℃，95℃和60℃，分別反應時間3 min，12 s和40 s，總共40個循環。以U6為內參，測定CT值。采用2-ΔΔCT表示miR-128a和miR-28-3p相對表達量，其中ΔΔCt=前列腺癌組(CT目的基因-CTU6)-健康對照組(CT目的基因-CTU6)。每個樣本重復3次。

1.4 觀察指標 觀察3組尿液中miR-128a和miR-28-3p表達水平，比較術前術后前列腺癌表達水平的變化，與臨床病理因素和預后的關系及其在診斷和判斷預后的診斷效能。

2 結果

2.1 3組尿液miR-128a和miR-28-3p表達水平比較 前列腺癌組尿液miR-128a表達水平明顯高于前列腺良性增生組和健康對照組(P<0.01)，且前列腺良性增生組表達水平明顯高于健康對照組(P<0.01)，術后前列腺癌組尿miR-128a表達較術前明顯降低(P<0.01)；而前列腺癌組尿液miR-28-3p表達明顯低于前列腺良性增生組合健康對照組(P<0.01)，且良性前列腺增生組明顯低于健康對照組(P<0.01)，術后前列腺癌組的miR-28-3p表達水平較術前出現明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1 3組尿液miR-128a和miR-28-3p表達水平比較

2.2 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平在診斷前列腺癌的效能 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平在診斷前列腺癌具有較高的靈敏度和特異性，將miR-128a和miR-28-3p進行Logistics分析，得方程=1.250XmiR-128a-2.351XmiR-28-3p+1.009，發現聯合檢測的靈敏度為76.9%，特異性為90.7%，其AUC為0.915明顯優于單個指標miR-128a(Z=3.859，P<0.01)和miR-28-3p(Z=2.861，P<0.01)，而miR-128a與miR-28-3p比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖1。

表2 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平診斷前列腺癌的效能

圖1 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平在診斷前列腺癌曲線下面積比較

2.3 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平與前列腺癌臨床病理因素的關系 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平與Gleason評分、腫瘤直徑、分化類型和腫瘤分期呈明顯相關性(P<0.05或<0.01)，而對年齡和PSA水平無明顯相關性(P>0.05)。見表3。

表3 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平與前列腺癌臨床病理因素的關系

2.4 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平與前列腺癌預后的關系 患者隨訪2年，41例患者死亡為死亡組，76例存活為存活組。死亡組的尿miR-128a表達水平明顯高于存活組(P<0.01)，而尿miR-28-3p表達水平死亡組低于存活組(P<0.01)。見表4。

表4 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平與前列腺癌預后的關系

2.5 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平在預測2年內死亡的效能 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平在預測2年內死亡具有較高的靈敏度和特異性，通過Logistics分析綜合兩指標得方程=1.091XmiR-128a-3.297XmiR-28-3p-0.876，聯合檢測的靈敏度為82.9%，特異性為82.9%，其AUC為0.895明顯優于單個指標miR-128a(Z=2.621，P<0.01)和miR-28-3p(Z=2.168，P<0.05)，而miR-128a與miR-28-3p比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表5，圖2。

表5 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平在預測2年內死亡的效能

圖2 尿miR-128a和miR-28-3p表達水平預測2年內死亡的效能

3 討論

診斷前列腺癌的金標準是組織活檢，但患者往往出現癥狀活檢時已經屬于晚期，并且屬于一種侵入性檢測手段。目前較為廣泛使用的PSA作為前列腺癌篩查和預后的重要指標，但其特異性和靈敏度仍不盡人意。有文獻表明miRNA通過外泌體進行細胞信息的傳遞，外泌體是一種囊泡樣結構，存在血液、尿液、精液和唾液等體液中，具有調節細胞的生物學行為[7]。研究表明尿液外泌體中的miRNA可以反映細胞的代謝情況，并且發現尿液中的外泌體具有miRNAs含量高，且比血液等更為穩定，能夠反映泌尿生殖系統的病變[8]。故尿液中外泌體的miRNA是最有潛力成為診斷前列腺癌和預后判定的重要無創分子標記物[9]，為前列腺癌的診斷和預后判定開辟了一條新的路徑。

本研究發現前列腺癌組尿液表達miR-128a水平明顯高于良性前列腺增生組和健康對照組，且手術后其表達水平明顯下降，說明miR-128a參與了前列腺癌的發生發展，與前列腺癌具有明顯相關性。本研究還發現與Gleason評分、腫瘤直徑、分化類型和腫瘤分期具有明顯的相關性，說明尿液中miR-128a表達水平高低與前列腺癌的惡性程度具有明顯相關性，與前列腺癌分期相關。本研究通過隨訪2年，發現與死亡組比較前列腺癌患者生存患者尿液中的miR-128a表達水平出現明顯降低，說明尿液miR-128a表達水平是前列腺癌預后的重要指標。現已知miR-128a在乳腺癌和神經系統的腫瘤中出現明顯下降[10]，表現為抑癌基因，而在我們研究中發現其表達出現明顯升高，說明在前列腺癌患者中miR-128a為促癌基因，對前列腺癌的發生發展具有促進作用。與郭學軍等[11]研究發現miR-128a在肝癌組織中呈高表達，并且認為miR-128a能夠促進肝癌細胞的增殖類似。本研究開發現尿液miR-128a表達在診斷前列腺癌患者的靈敏度為61.5%，特異性93.3%，AUC為0.815，說明尿液外泌體中的miR-128a在診斷前列腺癌具有一定的臨床診斷價值。本研究還發現在預測2年內死亡方面具有較高的診斷效能，故對預測2年內死亡具有較高的診斷效能，說明尿液miR-128a表達為預測預后較好的指標。

本研究發現前列腺癌患者尿液中miR-28-3p表達水平明顯低于良性前列腺患者和健康體檢者，且手術后尿液中miR-28-3p表達出現明顯升高，說明miR-28-3p在前列腺癌中是重要的保護基因，作為抑癌基因的角色，對前列腺癌的發生發展具有重要作用。有研究表明miR-28-3p在食管鱗狀細胞癌[12]出現明顯高表達，而在結腸癌的研究中發現出現明顯低表達[13]，說明miR-28-3p在不同腫瘤中有著不同的作用。與文獻表達血清miR-28-3p表達與非小細胞肺癌患者的預后相關[14]一致。本研究還發現尿液中miR-28-3p表達水平與診斷前列腺癌和判斷預后具有較高的效能，AUC為0.915明顯高于單獨miR-128a和miR-28-3p指標的檢測，說明兩者指標在檢測前列腺癌具有一定的互補作用。本研究還發現聯合檢測尿液中miR-128a和miR-28-3p水平在預后2年內死亡的靈敏度和特異性均高達82.9%，曲線下面積為0.895，均高于單純指標的檢測，說明兩指標在預測預后方面具有某種聯系，類似癌基因和抑癌基因這兩種基因，內在存在一定的聯系，故對于尿液miR-128a表達>3.753和miR-28-3p表達≤1.2患者是否需要采取進一步的干預，這些干預是否能夠改變預后及其可能的機制還需要進一步研究。

綜上所述，MiR-128a和miR-28-3p參與了前列腺癌的發生發展，在診斷前列腺癌和判斷預后具有重要臨床價值。