穩定表達TIGAR基因的BHK-21細胞系的構建及其對新城疫病毒增殖效果的評價

栗永華，劉 偉，徐智凱，劉煒瑋，孫英杰，仇旭升，譚 磊，宋翠萍，廖 瑛，丁 鏟，孟春春

(中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241)

新城疫(Newcastle disease，ND)是危害我國養禽業的嚴重疫病之一，新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)主要通過干擾素、TNF途徑和caspase途徑誘導受感染細胞發生細胞凋亡，從而產生病變效應[1]。p53抑癌蛋白在細胞應激反應和抑制腫瘤惡性發展中起著重要作用，p53蛋白在DNA修復、細胞凋亡[2]、防止腫瘤細胞的增殖[3-4]以及腫瘤的形成[5-7]等方面發揮了重要的作用。

TP53誘導的糖酵解和凋亡調節因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR)的表達降低了細胞內果糖-2，6-二磷酸酶(fructose-2，6-bisphosphatase，F-2，6-P2)的水平，磷酸果糖激酶降低，果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate，F-6-P)水平升高，從而抑制了糖酵解，使6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate，G-6-P)進入磷酸戊糖(pentose phosphate pathway，PPP)途徑增加[8-9]，降低了細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)的含量[10]，從而減少細胞凋亡和DNA損傷，導致內源性TIGAR表達對p53誘導的細胞死亡產生抑制作用[11]。

有研究表明，TIGAR在皮層神經元預處理后，增加PPP途徑，促進還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的產生，清除ROS，抑制細胞凋亡從而維持細胞存活[12]。一些研究表明，p53基因通過平衡TIGAR和DRAM具有調節應激誘導凋亡和自噬[13-14]。本研究旨在構建有利于NDV增殖的疫苗候選細胞株，所以選用的細胞是易于NDV增殖的BHK-21細胞，在前人研究的基礎上，擴增出雞TIGAR基因并首次擴增出倉鼠的TIGAR基因，構建穩定表達TIGAR基因的BHK-21細胞系。并評價NDV中強弱毒株在不同細胞系中的增殖滴度，意在比較不同來源的TIGAR基因發揮抗凋亡功能差異。為是否可以借助TIGAR基因構建的穩定過表達細胞系，使NDV在疫苗生產中突破不能體外大量擴增的瓶頸作出新的嘗試。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株、病毒、細胞

NDV強毒株ZJ1購于中國獸醫藥品監察所；雞源3×Flag-TIGAR質粒[20]、Phage質粒、PMD 2G質粒、PAX質粒、Polyboren、NDV中強毒SH15、NDV弱毒株LaSota、NDV強毒株Herts/33、293T細胞系和BHK-21細胞系為本實驗室保存，DH5α感受態細胞為天根公司產品。

1.2 抗體與試劑

Flag抗體(貨號8146S)、β-actin抗體(貨號3700S)、PARP抗體(貨號9532S)和Caspase 3兔抗體(貨號29629)均購于Cell Signaling Technology公司；NotⅠ限制性內切酶(貨號FD0593)、XbaⅠ限制性內切酶(貨號FD0684)、DMEM培養基均購于美國Thermo Fisher公司；Blasticidin S HCL(貨號S7419)購于Selleck公司；無內毒素質粒大提試劑盒(貨號DP117)購于天根生化科技(北京)有限公司；SYBR Green qPCR mix(貨號2092)購于廣州東盛生物科技有限公司；Trizol、Alexa FlourTM 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit為Thermo Fisher公司產品，TaqDNA聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶為諾唯贊公司產品，M-MLV、RNasin、FuGen轉染試劑為Promega公司產品，ECL發光液為圣爾公司產品。

1.3 方法

1.3.1 設計倉鼠TIGAR基因和雞TIGAR基因的相關引物 根據雞TIGAR基因的序列(登錄號MH511993.1)以及GenBank預測的倉鼠TIGAR基因的序列(登錄號：XM_005084096.3)設計引物，見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.2 重組慢病毒質粒的構建 將BHK-21細胞按照106的細胞密度接種于6孔板中，待長滿后，用800 μL Trizol裂解細胞提取RNA，加入Oligo 18T逆轉錄為cDNA。再分別以提取的倉鼠cDNA和前期構建的雞源3×Flag-TIGAR質粒為模板，進行PCR擴增，隨后酶切連入Phage包裝質粒載體。

1.3.3 構建、鑒定及篩選穩定表達倉鼠源和雞源TIGAR基因的細胞系 將293T細胞按照2×105的細胞密度傳至100 mm的細胞培養皿中。每皿轉染PAX(6 μg)、PMD 2G(3 μg)和Phage-TIGAR(9 μg)。轉染60 h后，將包裝好的慢病毒上清收集凍存備用。隨后取適量包裝好的慢病毒接種于生長狀態良好的BHK-21細胞中，并加入2 μL polyboren提高感染效率。繼續培養8 h后更換維持液，并在維持液中加入終濃度為0.4 mg·mL-1的Blasticidin進行加壓篩選。對存活細胞用有限稀釋法進行亞克隆篩選，將單克隆生長的細胞分別在核酸水平和蛋白水平對TIGAR基因進行鑒定。并將陽性細胞連續傳代30次，每隔10代使用qPCR引物鑒定TIGAR基因的表達量以及傳代穩定性。采用20 μL qPCR體系：qPCR Mix 10.0 μL，Primer-F、Primer-R各0.4 μL，DNA 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL；qPCR程序：94 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s，40個循環。

1.3.4 流式檢測重組細胞系的自然凋亡率及抗凋亡能力 將BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細胞按照1×105的數量接種于6孔板，每24 h收集細胞樣品于離心管中，直到192 h。將細胞樣品于4 ℃ 1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，用預冷的PBS洗3次，加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞，分別再加入5 μL PI和25 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min，隨后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。隨后將上述3種細胞按照1×106的數量接種于6孔板中，分別在培養24和48 h時，使用凋亡誘導劑Staurosporine預先處理2 h后，再使用流式技術檢測細胞凋亡率。

1.3.5 Western blot檢測重組細胞系的凋亡通路變化情況 將BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細胞系按照1×106的數量接種至6孔板中，待細胞長至70%～80%時，將Herts/33病毒按照0.1 MOI感染細胞。在接毒后的30和36 h收集蛋白樣品，使用Western blot檢測凋亡相關蛋白的變化情況，并使用image J軟件掃描蛋白灰度。

1.3.6 病毒生長滴度測定 將ZJ1、SH15和LaSota 病毒株按照0.01 MOI的病毒量感染BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細胞，在感染后每隔24 h收集細胞上清至96 h，將細胞上清作為病毒原液檢測細胞上清中病毒的TCID50。

2 結 果

2.1 Western blot鑒定亞克隆細胞

將測序鑒定為陽性的BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細胞經過亞克隆后擴大保存，并用Western blot(Flag抗體)鑒定外源TIGAR基因的表達情況。結果顯示，BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細胞系均獲得高表達細胞株(圖1)，表明兩種細胞系構建成功。

A.BHK-21細胞中穩定表達倉鼠TIGAR基因；B.BHK-21細胞中穩定表達雞TIGAR基因

2.2 qPCR鑒定重組細胞的穩定性

qPCR鑒定結果表明，所得到的BHK-21-chTIGAR細胞中雞源TIGAR基因和BHK-21-hamTIGAR細胞中倉鼠源TIGAR基因的開放閱讀框序列cDNA已經穩定的整合到細胞基因組中，能夠隨著BHK-21細胞系傳代而穩定持續地轉錄和表達且序列無突變(圖2)。

圖2 qPCR檢測BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細胞穩定性

2.3 重組細胞系的自然凋亡率

流式細胞儀檢測結果(圖3)表明，BHK-21-hamTIGAR細胞在培養48和72 h后，細胞的自然凋亡率高于BHK-21細胞，且差異顯著(P<0.01)，在96和144 h其凋亡率顯著低于BHK-21細胞(P<0.05)，而在120 h無明顯差異。BHK-21-chTIGAR細胞的凋亡率在48、72、120和144 h時均明顯高于野生型BHK-21細胞，且差異極顯著(P<0.01)。

ns.P>0.05；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

存活試驗表明BHK-21-hamTIGAR細胞在生長到96 h時細胞存活率明顯高于BHK-21細胞，且差異顯著(P<0.05)，在144 h明顯高于BHK-21細胞，且差異極顯著(P<0.001)。而BHK-21-chTIGAR細胞的存活率在72和120 h明顯低于BHK-21細胞，且差異極顯著(P<0.001)，在96和144 h低于BHK-21細胞，且差異顯著(P<0.05)。倉鼠源TIGAR重組細胞系在生長后期發揮了很好的抗凋亡作用，而雞源TIGAR細胞系存活率反而低于野生型BHK-21細胞。

2.4 重組細胞系的抗凋亡能力

使用Staurosporine對BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細胞提前2 h誘導凋亡，利用流式細胞儀檢測3種細胞的抗凋亡能力。結果見圖4A、B，在BHK-21細胞24 h誘導凋亡后，其早期凋亡率(2.3%)高于BHK-21-hamTIGAR細胞(1.1%)，且差異顯著(P<0.01)；但與BHK-21-chTIGAR細胞的早期凋亡率(2.6%)無顯著差異，晚期凋亡率三者均差異不顯著。在培養48 h誘導細胞凋亡后，BHK-21細胞的早期凋亡率(13.1%)明顯高于BHK-21-chTIGAR細胞的早期凋亡率(5.4%)和BHK-21-hamTIGAR細胞的早期凋亡率(4.9%)，且差異均極顯著(P<0.01或P<0.001)；但晚期凋亡率三者差異亦均無差異。流式檢測結果表明BHK-21-hamTIGAR細胞的抗凋亡能力明顯高于BHK-21和BHK-21-chTIGAR細胞。

A.流式細胞儀檢測細胞凋亡；B.統計分析細胞凋亡率；ns.P>0.05；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

2.5 重組細胞系凋亡通路變化的Western blot檢測

使用相同劑量Herts/33病毒感染BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細胞，并利用Western blot檢測細胞內的關鍵凋亡蛋白的變化情況。結果如圖5所示，在病毒感染后30和36 h時，BHK-21-hamTIGAR細胞中PARP、caspase-3的裂解蛋白表達量均低于BHK-21和BHK-21-chTIGAR細胞。BHK-21-hamTIGAR細胞在感染后30 h時，caspase-3表達量顯著(P<0.05)下降，PARP的表達量極顯著下降(P<0.001)。在感染后36 h時，PARP和caspase-3表達量均極顯著下降(P<0.01)。兩種凋亡指征蛋白在BHK-21-chTIGAR細胞中的表達量與野生型BHK-21細胞相比無明顯變化(Western blot圖片結果)，灰度掃描后的數據有統計學差異。上述結果在凋亡發生通路方面進一步證實了BHK-21-hamTIGAR具備較高水平的抗凋亡能力。

A.Western blot檢測BHK-21、BHK-21-chTIGAR和BHK-21-hamTIGAR細胞中PARP、caspase-3的表達量；B.30 h PARP/β-actin的相對表達量；C.36 h PARP/β-actin的相對表達量；D.30 h caspase-3/β-actin的相對表達量；E.36 h caspase-3/β-actin的相對表達量；ns.P>0.05；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

2.6 病毒生長滴度測定

為比較NDV在穩定表達TIGAR基因的重組細胞系和野生型BHK-21上的增殖水平，分別選取NDV的強、中、弱毒株進行比較。結果如圖6所示，感染新城疫強毒ZJ1 72 h時，BHK-21-hamTIGAR細胞內病毒滴度(5.67)高于BHK-21細胞(5.27)，且差異顯著(P<0.05)。感染新城疫中強毒SH15 48和96 h時，BHK-21-hamTIGAR細胞內病毒滴度(5.37和4.90)分別高于BHK-21細胞(5.13和4.67)，且差異顯著(P<0.05)。感染新城疫弱毒LaSota 72和96 h時，BHK-21-hamTIGAR細胞內病毒滴度(4.63和4.07)高于BHK-21細胞(4.63和3.77)，且差異顯著(P<0.05)。但在BHK-21-chTIGAR細胞上3種病毒不同時間點的病毒滴度均與BHK-21野生型細胞無差異。

A.新城疫強毒ZJ1；B.新城疫中強毒SH15；C.新城疫弱毒LaSota; ns.P>0.05; *.P<0.05

3 討 論

TIGAR蛋白是可以調節糖酵解和凋亡作用的蛋白，TIGAR蛋白通過抑制糖酵解途徑，增加磷酸戊糖途徑，可產生大量的5-磷酸核糖，是DNA修復和合成的重要原料[15]；還可以通過維持還原型谷胱甘肽所需的NADPH水平來調節ROS水平，保護細胞免受ROS的損傷并保持線粒體的完整性，細胞內NADPH升高，ROS和自噬活性降低[16]，因此TIGAR具有抑制細胞凋亡和自噬的作用[17-19]。

本研究首次擴增出倉鼠的TIGAR全長基因序列，構建慢病毒包裝重組質粒phage-hamTIGAR，利用包裝慢病毒的方法構建穩定表達TIGAR基因的BHK-21細胞系，通過Western blot和DNA測序篩選出表達TIGAR基因的BHK-21細胞系并將其純化；qPCR檢測結果表明所構建細胞系可長期穩定表達TIGAR基因。通過Western blot、流式細胞術檢測BHK-21-hamTIGAR細胞、BHK-21-chTIGAR細胞和BHK-21細胞的抗凋亡能力，其結果顯示，BHK-21-hamTIGAR細胞的抗凋亡能力高于BHK-21-chTIGAR細胞和BHK-21細胞，可能由于倉鼠TIGAR基因對于BHK-21細胞是內源基因，雞TIGAR基因對于BHK-21細胞是外源基因所導致。測定不同毒力的新城疫病毒在BHK-21-hamTIGAR細胞、BHK-21-chTIGAR細胞和BHK-21細胞上的生長曲線，結果表明新城疫的強中弱毒株在BHK-21-hamTIGAR細胞上的病毒滴度均高于BHK-21-chTIGAR細胞和BHK-21細胞，表明該細胞系可作為NDV高效增殖疫苗株的潛在選擇。

有研究將雞源TIGAR基因過表達至DF-1細胞系后，細胞的抗凋亡能力明顯增加[20]，本研究將雞源TIGAR基因穩定表達至BHK-21細胞系中，并沒有明顯的抗凋亡作用，可能是由于TIGAR基因對于DF-1細胞是內源性基因，而對于BHK-21細胞是異源性基因，所以其抗凋亡效果并不明顯，結果中倉鼠源TIGAR對于BHK-21細胞來說屬于內源性基因，所以其抗凋亡作用明顯，根據這兩個試驗可以初步猜測將內源性基因過表達后，可能發揮的作用更加明顯。付托[21]將人源TIGAR基因穩定表達至CHO細胞系中，通過提高NADPH從而維持細胞內氧化還原穩態，降低ROS的水平，抑制線粒體途徑引起的細胞凋亡，從而使CHO細胞抗凋亡能力提升。Ye等[22]用RNA干擾沉默HepG 2細胞中的TIGARmRNA后，主要通過細胞凋亡和自噬作用抑制細胞生長。當細胞受到應激時，TIGAR過表達導致細胞內NADPH升高，并降低ROS水平，抑制細胞自噬，隨后通過抑制ROS水平介導細胞凋亡[23-27]。用D-半乳糖處理神經母細胞瘤可以誘導細胞壞死性凋亡和自噬[28]。這些結果都與本文的結論相一致，表明通過控制TIGAR基因的表達可對細胞的凋亡水平進行精確調控。

4 結 論

利用慢病毒包裝法成功構建過表達TIGAR基因的BHK-21細胞系。構建的BHK-21-hamTIGAR細胞相比于BHK-21細胞和BHK-21-chTIGAR細胞其抗凋亡功能明顯提高，且病毒滴度也明顯增加，有助于新城疫病毒的復制，構建的BHK-21-hamTIGAR細胞可用作新城疫的候選疫苗細胞株。