牛結節性皮膚病病毒感染MDBK細胞后轉錄組差異表達分析

曹 政，居馬別克·夏拉巴依，李春燕，馬力克·艾則孜*

(1.重慶市畜牧科學院，重慶 402460；2.新疆維吾爾自治區動物衛生監督所，烏魯木齊 830011；3.陸軍軍醫大學第一附屬醫院全軍臨床病理學研究所，重慶 400000)

牛結節性皮膚病(lumpy skin disease，LSD)是由牛結節性皮膚病病毒(lumpy skin disease virus，LSDV)所導致的傳染病，其臨床表現為病牛發熱、淋巴結腫大、局部形成結節或潰瘍，奶牛和小牛易感[1]；該病的發病率在2%～45%，致死率高達20%[2]。LSD可導致流產，公牛和母牛不育，體重下降以及牛奶產量急劇下降，皮張利用價值低，從而造成嚴重的經濟損失[1]。世界動物衛生組織(OIE)將其列為必須通報的疫病[3]。

LSD最早暴發于非洲，自2012年以來，該病已在中東、巴爾干地區、高加索南部和俄羅斯聯邦的部分地區迅速傳播[4]，2015年，從土耳其傳播到希臘東北部。并于2016年春季再次暴發，這次疫情波及到東南歐的多個國家[5]。2019年8月，LSD首次傳入我國新疆伊犁州，這種遠距離的跨境傳播方式無疑加大了防控難度。目前，疫苗接種是最有效的預防LSD的方法，但迄今并無有效的治療方法和疫苗產品。因此，鑒于我國首次暴發疫情，掌握我國流行毒株的特性及其與宿主細胞的相互作用將有利于加快新型疫苗的研發。

本研究中作者從暴發地采集了牛皮膚病變組織，接種MDBK細胞進行了病毒分離，并采用透射電鏡觀察病變組織及病毒感染后的MDBK細胞，同時，對感染后24 h的MDBK細胞進行轉錄組學分析，篩選差異表達基因并將其按功能分類，分析它們參與的細胞信號通路。本研究將為闡明LSDV與宿主相互作用及其致病機制提供線索，從而為疫苗產品的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

牛病變皮膚組織采自新疆伊犁州，MDBK細胞由重慶市畜牧科學院保存。牛結節性皮膚病病毒熒光PCR檢測試劑盒購自北京森康生物技術有限公司。PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。熒光定量PCR引物及Tagman探針委托上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 病毒分離與鑒定

將無菌采集的牛病變皮膚組織做超薄切片，負染后用投射電子顯微鏡觀察病變組織。同時將病變組織在無菌條件下研磨，用PBS(含10%青鏈霉素)重懸，10 000g離心10 min，上清經0.22 μm無菌過濾。取1 mL濾液于30 mL無血清的DMEM培養基中，加入已長成單層的MDBK細胞，5% CO2，37 ℃孵育1 h，棄上清，并用PBS洗3次，添加含2% FBS的DMEM繼續培養，至90%細胞出現成團、擠壓等細胞病變(CPE)時，反復凍融細胞液3次，10 000g離心10 min收集上清備用。

將保存的細胞上清液進行連續梯度稀釋(10-1～10-7)，取部分稀釋梯度樣品用牛結節性皮膚病病毒熒光PCR檢測試劑盒進行鑒定。同時取各稀釋梯度樣品各100 μL加入已接入MDBK細胞的96孔板，連續培養觀察6 d，通過Reed-Muench法計算病毒TCID50效價。取100TCID50的LSDV接種對數生長期的MDBK細胞，培養24 h后固定細胞，通過透射電子顯微鏡觀察病毒粒子形態。

1.3 細胞培養

取對數生長期的MDBK細胞鋪于6孔細胞培養板，當單層細胞匯合度約80%時，接種100TCID50的LSDV，孵育1 h后，更換含2% FBS的維持液，24 h后收獲細胞并命名為LSDV-1、LSDV-2和LSDV-3；未接毒的細胞作為對照組，并命名為NC-1、NC-2和NC-3。

1.4 總RNA提取

從組織樣本中提取總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳初步檢測RNA完整性及是否有DNA污染，通過Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測RNA完整性，利用Nano-Photometer Spectrophotometer檢測RNA純度。

1.5 文庫構建與測序

采用建庫試劑盒NEBNext?UltraTMRNA Library Prep Kit構建cDNA文庫。首先通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA，并用二價陽離子將得到的mRNA隨機打斷。以片段化的mRNA為模板，隨機寡核苷酸為引物合成cDNA 第一條鏈，隨后以第一鏈為模板合成cDNA第二條鏈。純化雙鏈cDNA，然后經過末端修復、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選250～300 bp的cDNA，PCR擴增，純化后獲得文庫。最后使用Agilent 2100 bioanalyzer對文庫的插入片段大小(insert size)進行檢測，符合預期后，qRT-PCR 對文庫有效濃度進行準確定量。質檢合格的文庫采用Illumina Next Seq500進行雙末端測序。

1.6 數據質控

為了保證數據分析的質量及可靠性，需對原始數據進行過濾。主要包括去除帶接頭(adapter)的reads、去除含N(N表示無法確定堿基信息)的reads、去除低質量reads(Qphred≤20的堿基數占整個read長度的50%以上的reads)。同時，對clean data進行Q20、Q30和GC含量計算。

1.7 差異基因篩選

使用DESeq2軟件(1.16.1)進行兩個比較組合之間的差異表達分析(每個組3個生物學重復)。使用Benjamini和Hochberg來調整所得P值以控制錯誤發現率。以P值<0.05、|log2(fold change)|>1為標準篩選差異表達基因。

1.8 差異基因富集分析

通過Cluster Profiler(3.4.4)軟件從生物學過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)進行差異表達基因的GO(Gene Ontology)富集分析，當校正后的P值小于0.05時，認為該GO功能存在顯著富集情況。同樣采用Cluster Profiler(3.4.4)分析信號通路數據庫KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)中差異表達的基因，并以校正的P值小于0.05為條件判斷信號通路的顯著性。

1.9 差異表達基因的RT-qPCR驗證

為進一步驗證轉錄組分析結果，本試驗在顯著富集的信號通路中隨機選取了5個上調表達、5個下調表達的差異表達基因進行RT-qPCR驗證。病毒感染細胞后24 h，提取總RNA，并將其反轉錄成cDNA；然后根據TaKaRa RT-PCR試劑盒說明書進行擴增，qPCR引物與Tagman探針委托上海生工生物工程有限公司合成。以GAPDH作為內參基因，擴增結果根據公式2-ΔΔCt計算各基因的相對表達量，采用GraphPad Prism 8統計作圖。

2 結 果

2.1 病毒分離與鑒定

LSDV屬于痘病毒科、羊痘病毒屬，由核心、側體和包膜組成。牛皮膚病變組織制備超薄切片后進行負染，通過電鏡觀察可見病變組織中存在具備典型痘病毒形態的病毒粒子(圖1A)。將病變組織研磨后的上清液接入MDBK細胞培養，再通過電鏡觀察，可見典型的橢圓形痘病毒樣粒子，大小約340 nm×250 nm，與痘病毒的平均長、短徑值320 nm×260 nm 基本相符；并且可以明顯看到病毒粒子的包膜和核心結構(圖1B)。利用牛結節性皮膚病病毒熒光PCR檢測試劑盒檢測不同稀釋梯度的細胞培養上清，結果如圖2所示，細胞上清液中LDSV檢測結果為陽性。綜合電鏡觀察與熒光PCR檢測結果可知，本試驗成功從牛病變組織中分離到LDSV。

圖1 透射電鏡觀察LSDV

圖2 LSDV熒光PCR鑒定結果

2.2 數據質量分析

感染組和對照組原始測序數據經過濾后(表1)，Q20(%)和Q30(%)值均大于90%，表明質控后得到了高質量的測序數據。

表1 測序數據統計分析

2.3 差異基因篩選

采用edgeR軟件篩選出P-value<0.05，|log2FC|>1 的顯著差異表達基因，結果顯示(圖3)，病毒感染細胞24 h后，差異表達基因共499個，其中112個基因上調表達，387個基因下調表達。

圖3 差異表達基因火山圖

2.4 GO富集分析

利用Goatools數據庫對差異表達基因進行功能富集分析，結果發現這些差異基因富集的GO terms共有4 054個，其中顯著富集的有259個，涉及BP、CC和MF 3大類。圖4為前30條顯著富集的GO terms，由圖可知，與生物過程有關的GO terms最多，高達22個，富集最顯著的是蛋白激酶活性調節，其次是細胞對異源刺激的應答以及血管內皮生長因子的調節和囊泡運輸過程調節。CC中GO富集最顯著的是內質網輸出位點，此外，與囊泡相關的差異基因富集較多。MF中差異表達基因主要富集在膠原結合、泛素蛋白連接酶活性和GTP酶結合等terms。

圖4 前30條顯著富集的GO terms

2.5 KEGG富集分析

采用KOBAS對差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析，發現它們富集到247條信號通路中，前20個富集的信號通路如圖5所示。在富集的信號通路中有11條信號通路存在顯著性變化(P-value<0.05)，如表2所示，MAPK信號通路(MAPK signaling pathway，ID：bta04010)的變化最大，其次是不飽和脂肪酸合成(biosynthesis of unsaturated fatty acids，ID：bta01040)與膽汁分泌(bile secretion，ID：bta04976)，富集的差異基因分別有15、3和4個。同時與免疫相關的差異基因主要集中在變化最大的MAPK信號通路中，主要有絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶3(PPP3CA)、促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶1(MAP3K1)、白介素1α(IL1A)與白介素1β(IL1B)，這一結果可為進一步研究LDSV的免疫源性奠定基礎。

表2 顯著富集信號通路及其差異表達基因

圖5 前20條富集的KEGG信號通路

2.6 RT-qPCR驗證

為了進一步驗證轉錄組差異分析結果的準確性，本文從顯著性變化的11條信號通路中隨機篩選了5條上調表達與5條下調表達的基因進行RT-qPCR驗證，結果如圖6所示，IL1A、IL1B、MAP3K1、HSD17B12和STAT4基因表達下調，NGF、NROB2、WNT11、AXIN2和CYP46A1基因表達上調，結果與轉錄組測序一致，證明了此次結果的可靠性。

圖6 差異表達基因的RT-qPCR驗證

3 討 論

世界動物衛生組織(OIE)將牛結節性皮膚病列入法定報告傳染病清單，表明其具有快速傳播潛力，且有能力造成嚴重的經濟損失。LSD起源于非洲，后在中東、巴爾干地區、高加索南部和俄羅斯聯邦、土耳其、希臘東北部及東南歐的多個國家流行。2019年8月，LSDV首次傳入我國新疆伊犁州，劉平等[6]調查發現，此次疫情分布于察布查爾縣、伊寧市和霍城縣等3個地區的17個鄉鎮或場點，發病率為17.0%～36.2%。本研究首次將中國境內分離到的LSDV感染MDBK細胞，然后進行轉錄組分析，以期為后續疾病檢測及疫苗研發提供理論依據。

通過GO和KEGG分析得知，差異表達基因主要富集在MAPK信號通路，MAPK是將信號從細胞表面傳導至細胞核內部的重要傳遞者，是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一，表明細胞被攻擊后發生了一系列的信號轉導。其次不飽和脂肪酸及膽汁分泌兩個信號通路也發生了顯著變化，表明病毒入侵后，細胞的代謝也受到了影響。

在這些主要信號通路中，顯著變化且參與天然免疫應答的基因有MAP3K1、PPP3CA、IL1A和IL1B。MAP3K1是MAP3K家族成員之一，是1個196 ku的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，可被生長因子、促炎細胞因子、激素、神經遞質、低溫、高滲等多種因子(素)激活[7-8]，MAP3K1調控著真核細胞的生存、凋亡、運動與遷移[9-10]，且大量研究表明，其在腫瘤細胞分化、侵襲和轉移中發揮著重要作用。本研究發現，LSDV感染后，MAP3K1在MDBK細胞中的表達顯著下調，提示病毒感染影響著細胞的命運。與MAP3K1的磷酸化作用相反，PPP3CA是一個絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶，其脫磷酸化作用可以調節細胞因子介導的T細胞活化[11-12]。同時，PPP3介導的信號通路可調節細胞增殖、血管平滑肌細胞分化、心血管形態發生、心肌肥大和免疫應答等多種生理過程[13-14]。本研究中，PPP3CA的顯著變化可能參與了細胞的免疫防御。

此外，參與免疫應答的差異表達基因還有HIF1A、RORA、LRRK2、AP3B1和ANO6等，其中HIF1A和RORA與血管內皮生長因子調節相關，LRRK2、AP3B1和ANO6與細胞器及內質網小泡介導的蛋白轉運相關。HIF1A可被乏氧及炎癥細胞因子所激活，與炎癥和癌癥具有密切關系；轉錄因子RORA不僅表達于多種器官組織，還在巨噬細胞、淋巴細胞和髓細胞中表達[15]，在細胞增殖分化、機體穩態、代謝調控及免疫調節中發揮重要作用[16-17]。因此，HIF1A和RORA的差異表達可能是細胞抵御外來病毒，增強免疫應答作出的響應。研究表明，LRRK2可與Sec16A相互作用從而調節內質網出口位點的蛋白輸出功能[18]；AP3是一種銜接蛋白復合體，主要負責對高爾基體合成的特定蛋白進行篩選和包裝，然后轉運至多種溶酶體相關細胞器[19-20]。AP3B1編碼AP3蛋白復合體的β 3A亞基，其突變會影響膜泡運輸過程，從而導致高爾基體合成的蛋白無法到達特定部位發揮功能。本研究中，LRRK2和AP3B1顯著下調，表明病毒入侵細胞后，細胞通過阻止某些蛋白的運輸從而發生一系列復雜的變化。

4 結 論

通過轉錄組分析，發現MDBK細胞在感染LSDV后，有499個基因發生差異性表達。其中，上調表達的基因有112個、下調表達的基因有387個。通過對基因注釋發現，差異表達基因主要集中在絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，而且參與天然免疫且涉及細胞凋亡的MAP3K1基因表達呈現顯著下調，提示LDSV感染會影響MDBK細胞的遷移與凋亡等過程。除此之外，LDSV也引起MDBK細胞的不飽和脂肪酸及膽汁分泌兩個信號通路發生了顯著變化。本研究豐富了LDSV的轉錄組信息，而且為LDSV的致病機制與MDBK細胞的抗病毒研究也提供了基礎。