牛肺泡表面活性蛋白A的分離純化及抗菌活性分析

李 楠，張建樓，張永紅，鄭志強，霍珊珊，仲 飛,翟向和

(河北農業大學動物科技學院/動物醫學院，河北省獸醫生物技術創新中心，河北省牛羊胚胎工程技術創新中心，保定 071001)

表面活性蛋白(surfactant protein，SP)是在人和動物肺泡表面、羊水等組織中存在的一類非特異免疫防御分子[1-3]，動物的SP有4種，即SP-A、SP-B、SP-C和SP-D。SP-B和SP-C主要功能為降低肺泡表面液體張力，促進動物的呼吸作用[4-5]；而SP-A和SP-D則是肺泡表面的防御分子，在抵御外來病原的侵入發揮重要作用[6-7]。SP-A含有5個獨立的結構區：信號肽區，N端二硫鍵形成區(含半胱氨酸殘基)、含Gly-X-Y 3肽重復結構的膠原樣區(collagen-like region, CLR)、疏水α-螺旋頸區和C端球狀碳水化合物識別區(carbohydrate recognition domain, CRD)(也稱凝聚素區)。因其與SP-D相似都具有CLR和CRD區域，因此，同屬于膠原凝聚素家族[8-9]。在Ca2+存在的條件下，SP-A或SP-D的CRD區可識別寡糖鏈并與其結合。許多病原，如細菌、囊膜病毒、真菌等，其表面的糖類物質均可被SP-A和SP-D識別并結合，引起病原的凝聚[10-12]，從而抑制病原對宿主細胞的入侵。此外，這兩種表面活性蛋白還有刺激單核-巨噬細胞的活性[13]，促進其吞噬作用，增強其對多種病原菌的攝取，抑制病原菌的增殖。如人SP-A可抑制嗜血桿菌、綠膿桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及A型鏈球菌的增殖，顯示明顯的抗菌活性[14]。此外SP-A還可與多種病毒囊膜糖蛋白，如流感病毒的血凝素(糖蛋白)[15]、呼吸道合胞病毒的糖蛋白[16]、人類免疫缺陷病毒的gp120糖蛋白[17]等結合，介導吞噬細胞對病毒的識別，中和病毒，從而表現出抗病毒作用。

目前，關于人以及小鼠和家兔等實驗動物的SP-A研究較多，但對其他動物的研究較少。筆者實驗室曾就豬SP-A進行了較為系統的研究，分別制備了重組豬SP-A和分離純化了天然豬SP-A，發現SP-A可抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒在豬巨噬細胞中的復制，抑制多種革蘭陰性/陽性菌在體外的增殖，表明豬SP-A具有明顯的抗菌和抗病毒活性[18-19]。

然而目前尚未見對牛SP-A、SP-D研究的相關報道。有許多致病性細菌和病毒均可感染牛的肺部，引起肺部炎癥。存在于肺泡表面的SP-A是否對侵入肺部的病原體有抑制作用尚未見報道。為探討牛SP-A的抗菌和抗病毒活性，需要獲得大量牛的SP-A。為此本試驗通過親和吸附層析法從牛肺泡灌洗液中分離純化了牛天然SP-A，并在體外對其抗菌活性進行初步分析。

1 材料與方法

1.1 牛肺和菌株

牛肺由河北保定市保北清真肉聯廠提供。致病性大腸桿菌、無乳鏈球菌購于中國獸醫藥品監察所微生物菌種保藏管理中心。大腸桿菌DH5α和金黃色葡萄球菌分離株為本室保存的菌種。

1.2 主要試劑及緩沖液

DMEM培養基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；Sepharose-4B為Pharmacia產品；山羊抗人SP-A抗體(對牛SP-A有交叉反應)及堿性磷酸酶標記的兔抗山羊IgG(IgG-AP)購自Santa Cruz公司；丁二烯砜(butadiene sulfone)和D-麥芽糖(maltose)購自Sigma公司；其他試劑均為進口或國產分析純。吸附緩沖液：5 mmol·L-1CaCl2，100 mmol·L-1NaCl，50 mmol·L-1Tris-HCl，0.02% NaN3，pH 7.4；洗滌緩沖液：含1 mol·L-1NaCl的吸附緩沖液；洗脫緩沖液：50 mmol·L-1Tris-HCl, 100 mmol·L-1NaCl, 5 mmol·L-1EDTA和0.02% NaN3, pH 7.4.

1.3 麥芽糖-Sepharose(MS)吸附膠粒的制備

參考本室建立的方法進行制備[19]。首先活化Sepharose-4B膠粒：用蒸餾水潤洗Sepharose-4B膠粒3次，在20 mL 0.5 mol·L-1Na2CO3中懸浮，在攪拌下慢慢滴加2 mL丁二烯砜(雙功能基團試劑)，連續攪拌1 h。后用蒸餾水洗滌膠粒至中性，濾干后加入8 mL 20% D-麥芽糖溶液，攪拌30 h，使D-麥芽糖與Sepharose-4B膠粒進行共價交聯。用蒸餾水洗滌，用0.5 mol·L-1NaHCO3(含β-巰基乙醇)封閉1.5～2.0 h。最后用蒸餾水充分洗滌，并懸浮于適量的蒸餾水中，即為麥芽糖-Sepharose吸附膠粒(簡稱MS膠粒)。在MS膠粒中加入0.02%疊氮鈉，在4 ℃條件下保存備用。

1.4 牛SP-A的粗分離

用磷酸緩沖液(PBS)灌洗牛肺，收集灌洗液，在4 ℃下離心(2 000×g)10 min，將上清轉入另一干凈的離心管中，高速離心(13 800×g)40 min，收集富含SP-A的沉淀。向沉淀中加入20 mL含尿素的吸附緩沖液，攪拌1 h，再用吸附緩沖液在4 ℃下透析過夜，使SP-A變性、復性。在4 ℃下10 000×g離心20 min，收集上清液，即獲得SP-A粗提液。

1.5 牛SP-A的純化

MS膠粒用蒸餾水潤洗后，加4倍體積的吸附緩沖液平衡膠粒。加入等體積的上述制備的SP-A粗提液，室溫下攪拌40 min，使膠粒吸附SP-A。1 500×g離心5 min，用5倍體積的含1 mol·L-1NaCl的吸附緩沖液洗滌膠粒，膠粒裝柱后用洗脫緩沖液洗脫SP-A。

1.6 吸附緩沖液Ca2+和洗脫緩沖液EDTA對牛肺SP-A吸附和洗脫影響的分析

分別制備含不同Ca2+濃度(0、5、10、15、20、25 mmol·L-1)的吸附緩沖液和不同EDTA濃度(0、10、20、30、40、50 mmol·L-1)的洗脫緩沖液，分析Ca2+濃度對SP-A吸附的影響、EDTA濃度對SP-A洗脫的影響，以確定吸附時最適Ca2+濃度和洗脫時最適EDTA濃度。

1.7 牛SP-A純度分析及特異性鑒定

用SDS-PAGE對牛SP-A進行純度分析，用Western blot對牛SP-A進行特異性鑒定。主要操作過程：牛SP-A樣品先經過12.5 %丙烯酰胺膠進行SDS-PAGE電泳，電泳后用考馬斯亮藍對膠上的蛋白進行染色，通過觀察色帶是否單一和有無雜帶評價樣品純度，根據色帶密度估計樣品的相對含量。上述牛SP-A樣品經SDS-PAGE電泳后，將膠上的蛋白通過半干轉裝置(Bio-Rad)轉到硝酸纖維膜上，用含5 %脫脂奶粉的TBST(20 mmol·L-1Tri-HCl，pH7.4, 150 mmol·L-1NaCl, 0.05% Tween 20)封閉過夜后，用山羊抗SP-A抗體(1∶500，一抗)和堿性磷酸酶標記的兔抗山羊 IgG(IgG-AP)(1∶1 000，二抗)分別雜交后，最后用堿性磷酸酶底物，氯化硝基四氮唑藍(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)(Bio-Rad公司)進行顯色，通過拍照記錄檢測結果。

1.8 牛SP-A生物活性的檢測

利用細菌凝聚試驗檢測SP-A的生物活性。在含不同濃度SP-A(0、100、200、300 μg·mL-1)的 10 mL LB培養基中加入100 μL大腸桿菌DH5α(OD600 nm= 0.5)，在37 ℃下共同培養2 h，顯微鏡檢細菌凝聚狀態，觀察不同濃度的SP-A對細菌的凝聚作用，以評價SP-A的生物活性。

1.9 牛SP-A抗菌活性的檢測

參考張永紅等[19]測定豬SP-A抗菌活性的檢測方法，在含不同濃度牛SP-A(0、50、100、150、200、250 μg·mL-1)的LB液體培養基(10 mL)中，分別接種50 μL已經活化的金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和致病性大腸桿菌(OD600 nm= 0.25)，在37 ℃下，搖床培養6 h，測定細菌培養液的OD600 nm值，評價牛SP-A對不同細菌的抗菌活性。

1.10 數據統計

應用SPSS18.0軟件分析試驗數據，以t檢驗進行兩樣本均數差異顯著性分析。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著, NS表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 SP-A的分離純化及鑒定

從牛肺收集的肺泡液經高速離心后得到富含有SP-A的沉淀，即牛SP-A的粗制品(圖1 A)。將SP-A溶于PBS中，用MS膠粒吸附SP-A粗制品溶液中的SP-A，得到牛SP-A的純品(圖1 A)。制備的SP-A純品經SDS-PAGE電泳后在相對分子質量為30和60 ku處出現2條帶，純度達95%以上(圖1A-2)，而未經MS膠粒吸附的SP-A粗制品則呈現多個條帶，說明SP-A粗制品中含有其他雜蛋白(圖1A-1)。SP-A純品經Western blot檢測，分別在相對分子質量為30和60 ku處出現2條雜交帶(圖1B)，該結果與SDS-PAGE分析的結果一致，證實牛肺泡液中的SP-A以兩種形式存在，分別為SP-A單體蛋白和SP-A二聚體蛋白。上述結果也表明，本試驗制備的MS膠粒可以特異地吸附SP-A蛋白。上述的SDS-PAGE和Western blot檢測結果均顯示，單體SP-A的相對分子質量為30 ku，這與牛SP-A相對分子質量的理論計算值(25 ku)有明顯差異，這可能是SP-A分子中含有保守的N-糖基化位點(N178YT)，在合成過程中發生糖基化，致使SP-A在SDS-PAGE電泳時蛋白的泳動速度變慢，從而出現SP-A分子量偏高的現象。

A.牛SP-A 蛋白的SDS-PAGE鑒定(M.蛋白質相對分子質量標準；1.肺泡洗出液樣品；2.分離純化的牛SP-A蛋白)；B.牛SP-A蛋白的Western blot鑒定(M.預染蛋白質相對分子質量標準；1.牛SP-A蛋白)

2.2 不同純化條件對SP-A純化效果的影響

2.2.1 吸附緩沖液Ca2+濃度對MS膠粒吸附牛SP-A的影響 為了確定吸附緩沖液中最適的Ca2+濃度，用含不同Ca2+濃度(0、5、10、15、20、25 mmol·L-1)的吸附緩沖液分別吸附牛肺泡液中的SP-A，分析每克濕重MS膠粒吸附SP-A的質量(mg)。由圖2A所示，在一定范圍內(5～20 mmol·L-1)，隨著Ca2+濃度的增加，MS膠粒吸附SP-A的能力也隨之增加。當Ca2+濃度超過20 mmol·L-1后，吸附能力上升趨緩，所以20 mmol·L-1的Ca2+濃度為最適Ca2+濃度。

2.2.2 洗脫緩沖液EDTA濃度對牛SP-A從MS膠粒上洗脫的影響 為了確定洗脫緩沖液中最適的EDTA濃度，用含不同EDTA濃度(0、10、20、30、40、50 mmol·L-1)的洗脫緩沖液分別洗脫MS膠粒吸附的牛SP-A，分析其洗脫效果。圖2B數據顯示，在較低的EDTA濃度范圍內，隨著洗脫緩沖液EDTA濃度的增加，洗脫后洗脫液中牛SP-A含量不斷增加，當EDTA濃度在30 mmol·L-1時，SP-A的回收率達到85%。當EDTA濃度超過30 mmol·L-1后，洗脫液的SP-A含量增加不明顯，因此，選擇30 mmol·L-1濃度為洗脫緩沖液中EDTA的最適用量。

A.吸附緩沖液Ca2+濃度對SP-A純化效果的影響；B.洗脫緩沖液EDTA濃度對SP-A純化效果的影響

2.3 牛SP-A凝聚細菌活性的分析

動物SP-A均具有凝聚細菌和囊膜病毒的作用，所以對菌體或囊膜病毒的凝聚活性常用于評價SP-A是否具有生物活性。為確定制備的牛SP-A是否具有凝聚細菌的作用，利用大腸桿菌DH5α分析了牛SP-A的細菌凝聚活性。圖3結果顯示，與對照組(圖3A)相比，分離純化的牛SP-A可以使大腸桿菌發生凝聚(圖3B～D)，并且隨著牛SP-A濃度的增高，凝聚作用不斷增強，呈劑量依賴性。可見本研究制備的牛SP-A具有促進細菌凝聚作用，表明制備的牛SP-A具有生物學活性。

A.BSA(300 μg·mL-1)處理后大腸桿菌的狀態；B、C、D.用不同濃度牛SP-A(100、200、300 μg·mL-1)分別處理后大腸桿菌的狀態

2.4 牛SP-A抗菌活性的分析

為了確定制備的牛SP-A是否具有抗菌活性，本試驗在體外分別分析了SP-A對金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和致病性大腸桿菌增殖的影響。用不同濃度(0、50、100、150、200、250 μg·mL-1)的SP-A分別與已活化的不同細菌進行共培養，6 h后測定細菌培養液的OD600 nm值，分析牛SP-A對不同菌的抗菌活性。圖4結果顯示，隨著SP-A濃度的增加，3種被試細菌菌液的OD600 nm值均隨之降低，即SP-A對細菌增殖的抑制作用隨濃度的增加而增加(圖4A～D)。但SP-A對不同細菌的抑菌程度有所不同。當SP-A達到150 μg·mL-1時，對致病性大腸桿菌的抑菌程度已超過50%；而對于金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌(革蘭陽性菌)則需更高濃度才能達到相同的抑菌效果。上述結果說明，牛SP-A對金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和致病性大腸桿菌均有明顯的抑菌活性，且對革蘭陰性菌的抑菌效果高于革蘭陽性菌。

A.金黃色葡萄球菌；B.無乳鏈球菌；C.致病性大腸桿菌；*.P<0.05; **.P<0.01

3 討 論

本試驗利用共價交聯法將麥芽糖連接在Sepharose膠粒-4B上，制備成能夠特異吸附SP-A的MS膠粒。然后利用制備的MS膠粒從牛肺泡洗出液中吸附牛的SP-A蛋白。結果表明，制備的MS膠粒可以特異地與SP-A結合，由此制備的SP-A純度高達95% 以上。研究顯示，牛SP-A蛋白在自然條件下以兩種形式存在，即單體SP-A和二聚體SP-A。制備的SP-A具有凝聚細菌的能力，表明SP-A具有生物活性。抗菌活性檢測結果顯示，牛SP-A在體外對革蘭陰性菌(致病性大腸桿菌)和革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌)的增殖均有明顯的抑制作用，表明牛SP-A具有抗菌活性。這項研究不僅為進一步研究牛SP-A的生物學特性及抗菌活性提供了必要的條件，同時，為奶牛及肉牛生產研發潛在的抗菌制劑開辟了新的思路。

奶牛乳腺炎是奶牛的常見病和多發病，不僅影響奶牛的健康，同時嚴重影響奶牛的產奶量和奶的質量，給奶牛養殖業帶來嚴重的經濟損失[20-22]。金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌等是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌[23-24]，目前，常采用抗生素藥物對牛乳腺炎進行治療，抗生素在奶牛業中濫用不僅引起病菌的耐藥性問題，同時，也會引起藥物在牛體內和牛乳中的殘留, 給人類的食品安全帶來一定的隱患[25]。為此，本研究初步分析了牛SP-A對引起牛乳腺炎的3種常見病菌的抗菌活性，旨在為未來研發牛SP-A制劑用于防治奶牛乳腺炎提供依據。

牛肺泡液中含有多種蛋白，包括4種肺泡表面活性蛋白(SP),不同的SP蛋白理化性質有所不同[26-27]，SP-A和SP-D均屬于膠凝素家族成員，其分子中含有1個依賴鈣離子的糖識別區域(CRD)，所以在鈣離子存在的條件下，SP-A和SP-D可以識別多種糖類并與之結合[28-30]。利用這一特點，本試驗運用共價交聯法制備了麥芽糖(糖類)與Sepharose膠粒共價交聯的MS膠粒，使其能夠與牛肺泡液中的SP-A或SP-D蛋白進行特異結合，從而分離純化出牛的天然SP-A或SP-D。然而SP-B和SP-C分子中不含有CRD區域，所以不能被MS膠粒吸附。使人感興趣是盡管SP-A和SP-D均能被MS膠粒特異吸附，但由于兩者的結構和理化性質有不同之處，兩者的密度也有較大的差異，所以通過高速(13 800×g)離心法就可以將二者分開[26-27]，離心后的沉淀部分富含SP-A，而上清部分富含有SP-D。所以如果欲純化牛的SP-D蛋白，也可用MS膠粒從上清中吸附SP-D。

利用MS膠粒純化牛的SP-A，吸附緩沖液的Ca2+濃度和洗脫液的EDTA的濃度直接影響SP-A的純化效果，為優化SP-A純化條件，本研究分析了吸附緩沖液Ca2+濃度和洗脫緩沖液EDTA濃度對SP-A純化效果的影響，結果顯示，吸附緩沖液Ca2+濃度為20 mmol·L-1和洗脫液EDTA濃度為30 mmol·L-1，可獲得良好的分離純化效果。

動物SP-A的抗菌作用是通過多種途徑實現的，但主要是SP-A對病原菌或病毒的凝聚作用，當病原菌或病毒侵入肺時，存在于肺泡表面的SP-A以及SP-D就會使病原菌或病毒發生凝聚，防止它們侵入到肺細胞。同時，被SP-A和SP-D凝聚的病原菌或病毒容易被存在于肺泡表面的肺泡巨噬細胞等吞噬細胞所吞噬，進而達到徹底清除病原菌或病毒的目的，所以SP-A和SP-D對肺吞噬細胞針對病原的吞噬有調理作用[31-32]。有研究證實，SP-A和SP-D凝聚細菌后，還可通過增加細菌細胞膜的通透性抑制細菌的增殖[14]。本試驗在體外分析的SP-A對3種病菌表現的抗菌活性，推測主要是通過SP-A對細菌的凝聚作用和增加病菌細胞膜的通透性使細菌的增殖受到抑制所致。

這項研究為今后對牛SP-A的生物學特性及抗菌活性的研究提供了重要的試驗依據，同時，為SP-A抗菌制劑的研發提供了新的思路。在試驗中，筆者僅通過牛SP-A對引起牛乳腺炎的3種常見病菌的抗菌活性進行了初步分析，有關牛SP-A對其他病菌的抗菌活性、以及抗病毒、抗真菌的活性有待于進一步研究。

4 結 論

通過制備麥芽糖與Sepharose-4B凝膠共價交聯的MS膠粒，成功地從牛肺泡洗出液中分離純化出牛SP-A蛋白，純化的牛SP-A蛋白不僅具有凝聚細菌的生物活性，同時對多種病菌表現較強的抗菌活性。