杭州市5 279例新生兒耳聾基因突變篩查及突變攜帶者隨訪結果分析

梅瑾 王敏 王昊 何茶英 連結靜 傅婷婷 胡文勝

先天性耳聾是人類發病率較高的出生缺陷之一，尤其是在新生兒中多發。統計數據顯示該疾病在新生兒中的發病率為0.1%，其中一半的患兒與遺傳缺陷有關[1]。目前已知的耳聾相關并且已經作為臨床篩查目標的基因有GJB2、SCL26A4、GJB3、線粒體12SrRNA[2-3]。2012年北京市政府開展新生兒耳聾基因篩查民生項目，隨后成都、長治、南通、鄭州等城市也開展了新生兒遺傳性耳聾基因篩查工作[4-8]，促進了先天性耳聾的早發現、早診斷、早干預等防治工作。然而，杭州地區新生兒耳聾基因篩查項目開展較遲，有關耳聾基因的突變率等基礎數據及相關研究報道較少。為此，本研究采集2018 年6 月至2019 年12 月在杭州市婦產科醫院出生的5 279 例新生兒足底血，提取DNA 并應用微陣列芯片雜交法檢測4 個耳聾基因15 個位點，分析基因突變攜帶率和突變類型，結合新生兒聽力篩查結果，比較兩者相關性，對聽力篩查未通過的耳聾基因突變者進行耳聾全基因測序診斷確定基因型，隨訪其聽力發育和干預情況，以評估聽力-耳聾基因聯合篩查在先天性耳聾早期診斷與干預中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018 年6 月至2019 年12 月本院出生的新生兒5 279 例，男嬰2 797 例，女嬰2 482 例；出生孕周37～41（39.03±0.97）周；體重2 500～4 100（3 300±50）g；新生兒父母均來自杭州轄區的11 個區、縣（市）。排除重度窒息、重度黃疸、明顯先天缺陷及出生后轉新生兒病房治療的患兒。本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過，所有患兒監護人均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 新生兒足底血采集 由兒保科專業人員在新生兒出生72 h 內，在監護人知情同意并簽字下，按照《新生兒疾病篩查技術規范（2010 版）》和采血常規的要求，采集新生兒足底血，使用專用采血濾紙片制成2 個直徑≥8 mm 的血斑，充分滲透，自然晾干，獨立裝袋，送至實驗室進行耳聾基因檢測。

1.2.2 常見耳聾基因突變篩查 采用打孔器得到3 mm直徑的干血斑，使用十五項遺傳性耳聾相關基因檢測試劑盒（成都博奧晶芯生物科技有限公司，國械注準20173401343）進行檢測。按試劑盒說明要求，使用核酸提取試劑盒提取新生兒干血斑中的DNA，與空白樣本、陰性對照及陽性對照一起進行PCR 擴增。擴增完成后，使用微陣列芯片雜交法對標本進行4 個基因15 個位點的檢測[GJB2（c.35delG、c.235delC、c.176del16、c.299delAT），GJB3（c.538C＞T），SLC26A4（c.2168A＞G、c.919-2A＞G、c.1174A＞T、c.1226G＞A、c.1229C＞T、c.1975G＞C、c.2027T＞A、c.IVS15+5G＞A）和線粒體12SrRNA（m.1494C＞T、m.1555A＞G）]。對基因芯片篩查中出現突變位點的樣本使用Sanger 測序法進行驗證[3]。采血后2 周內報告結果。篩查結果分為未突變、雜合突變、純合突變、復合雜合突變以及復合突變[9]。未突變為檢測結果中未發現與耳聾相關的基因突變或基因型，雜合突變為同一基因里發現一種突變型，純合突變為同一基因里發現兩種一樣的突變型，復合雜合突變為同一基因里發現兩種不同突變型，復合突變為不同基因里各有一種突變型。對于線粒體12SrRNA 上同時出現的兩種突變，定義為線粒體異質突變；線粒體12SrRNA 上僅一種突變，定義為線粒體均質突變。

1.2.3 聽力篩查 由兒保科專業人員采用“兩階段篩查法”，即初篩和復篩，將結果錄入醫院產時信息系統，本研究數據從產時信息系統中提取。嚴格按照國家衛健委新生兒聽力篩查規范要求進行，初次診斷性聽力評估在3 個月內完成。初篩是在新生兒出生后滿48～72 h 使用畸變產物耳聲發射法（DPOAE）（德國麥科聽力儀器公司，MAICO Diagnostic GmbH ERO-SCAN 型）進行聽力測試，如果新生兒單耳或雙耳沒有通過測試，則記錄為“未通過”。初篩未通過者產后42 d 至兒童保健門診應用自動判別聽性腦干誘發電位檢查法（AABR）（德國麥科聽力儀器公司，型號：MAICO Diagnostic GmbH MB11 型）復篩，若初篩和復篩兩次均未通過測試，列為耳聾高危人群。結合耳聾基因篩查與診斷情況，3 個月內轉聽力診斷部門綜合評估聽覺能力，包括聽性腦干反應（ABR）、聲導抗檢查及外耳道檢查等。

1.2.4 耳聾基因診斷與父母基因篩查驗證 耳聾基因篩查結果由產前診斷中心辦公室專人管理，對新生兒耳聾基因突變攜帶者，電話通知其家長到本院遺傳咨詢門診接受遺傳咨詢和健康教育，在知情同意的情況下，對耳聾基因突變新生兒父母行耳聾基因篩查驗證，評估遺傳因素的作用，對GJB2 和SLC26A4 耳聾基因突變者行基因測序診斷以確定基因型。

1.2.5 隨訪內容 產前診斷中心辦公室專人隨訪耳聾基因突變和聽力篩查未通過新生兒出生3 個月后聽力診斷性檢查情況以及耳聾者的個性化干預措施落實情況（配戴助聽器或安裝人工耳蝸）。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0 統計軟件。計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耳聾基因突變情況 5 279 例耳聾基因突變篩查新生兒中，未突變4 999 例，突變280 例，其中雜合突變277 例，純合和復合雜合突變3 例，突變率為5.30%（280/5 279）。4 個耳聾基因中，GJB2 突變率最高，為3.05%（161/5 279），其中純合和復合雜合突變3 例，突變率為0.06%（3/5 279），雜合突變158 例，突變率為2.99%（158/5 279）；其余由高到低分別為SLC26A4 雜合突變84 例，突變率為1.59%（84/5 279）；GJB3 雜合突變18 例，突變率為0.34%（18/5 279）；線粒體12SrRNA 均質突變14 例，突變率為0.27%（14/5 279）；雙基因雜合突變3 例，突變率為0.06%（3/5 297）。GJB2 基因突變中c.235delC 位點突變最多，達131 例，突變率為2.48%（131/5297）；SLC26A4基因中c.919-2A＞G 位點突變最多，為59 例，突變率為1.12%，見表1。

2.2 耳聾基因突變者基因診斷及父母驗證情況 280例耳聾基因突變的新生兒父母均接受遺傳咨詢和健康教育，其中150 例新生兒父母依從性較好，在知情同意下，選擇了耳聾基因突變篩查驗證，結果135 例新生兒突變來源于無表型的父母一方，占90.0%。對2 例GJB2基因c.235delC 純合突變和1 例GJB2 基因c.235delC/c.299delAT 復合雜合突變新生兒進行GJB2 基因測序診斷，結果與篩查一致，見表1。另有19 例GJB2 和SLC26A4耳聾基因雜合突變新生兒進行基因測序診斷，發現其中4 例為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點復合雜合突變，父母經驗證為相應位點突變的攜帶者。

表1 280 例新生兒4 個常見耳聾基因突變篩查、基因診斷及父母驗證情況

2.3 耳聾基因篩查與聽力篩查比較 5 279 例耳聾基因突變篩查新生兒中，耳聾基因未突變者聽力篩查未通過率為0.05%（25/4 999），低于耳聾基因突變攜帶者的1.79%（5/280），差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 5 279 例新生兒耳聾基因篩查與聽力篩查比較（例）

2.4 耳聾基因突變者聽力診斷和干預隨訪情況 隨訪耳聾基因雜合突變新生兒277 例，其中2 例聽力篩查未通過，經GJB2 全基因測序，1 例為GJB2 基因c.235delC位點雜合突變，聽力診斷正常；另1 例為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點復合雜合突變，出生3 個月經聽力診斷性檢查，確診中度耳聾，準備安裝人工耳蝸；還對3 例聽力篩查通過而基因測序診斷為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點復合雜合突變新生兒進行隨訪，出生3 個月聽力均診斷正常。隨訪GJB2 基因純合/復合雜合突變新生兒3 例，聽力篩查雙耳均未通過，基因測序基因型與篩查一致；其中GJB2 基因c.235delC純合突變2 例，出生2 個月確診為重度耳聾，出生6 個月準備安裝人工耳蝸；GJB2 基因c.235delC/c.299delAT復合雜合突變1 例，出生2 個月確診為中度耳聾，準備配戴助聽器。另對14 例線粒體12SrRNA 突變攜帶者父母發放生活和用藥指導卡片，對18 例GJB3 基因突變攜帶者和3 例雙基因雜合突變者囑其父母注意聽力發育及生活指導。

3 討論

聽力障礙會直接影響患兒的語言發育，如果未早期發現，最終由聾致啞，給患兒的生長發育及社會生活帶來非常嚴重的影響，為此，應盡早發現和干預患兒，避免其因錯過最佳治療期而成為永久性聾兒，這一直是臨床工作者關注的重點。我國20 多年前就開展了新生兒耳聲發射結合聽性腦干聽覺誘發電位測試（金標準）[10]聽力篩查工作，該檢測無創，假陽性率低，為發現新生聾兒起到了巨大的作用。但并不是所有的聽力損傷都會在出生不久便發生，遲發性、漸進性甚至藥物性耳聾都無法用該法查出。隨著對耳聾基因的深入研究，已表明我國大部分先天性遺傳性耳聾由為數不多的幾個基因突變引起[11]，耳聾基因檢測已經成為防控遺傳性聾兒的重要措施[12-13]，在一定程度上彌補了聽力篩查的不足[2]。

本研究在5 279 例新生兒中檢出基因突變280 例，突變率為5.30%，與Zhang 等[14]報道的天津地區耳聾基因突變攜帶率為5.52%接近，比Chen 等[15]對我國18 篇新生兒耳聾基因篩查的文獻進行Meta 分析，發現新生兒耳聾基因陽性檢出率為4.7%略高，也高于阮宇等[16]4.51%和王川等[17]4.38%的報道，原因可能是我國不同地區新生兒耳聾基因篩查方式存在差異，耳聾基因突變陽性檢出率不盡相同。本研究篩查4 個基因15 個位點，而阮宇等[16]篩查的是4 個基因9 個位點，由于篩查突變位點的增加，耳聾基因突變陽性檢出率有所增高。本研究4 個基因中，GJB2 基因突變最高，純合和復合雜合突變率為0.06%，雜合突變率為2.99%；其次為SLC26A4 雜合突變，突變率為1.59%。GJB2 基因中，c.235delC 突變最多，達131 例，突變率為2.48%；SLC26A4 基因中c.919-2A＞G 突變最多，為59 例，突變率為1.12%，與阮宇等[16]報道一致，表明了杭州地區耳聾基因突變攜帶率和常見突變類型與國內其他地區研究報道基本一致。

本研究280 例耳聾基因突變中，150 例新生兒父母進行了耳聾基因突變篩查驗證，結果135 例新生兒突變來源于無表型的父母一方，占90.0%。還對22 例攜帶GJB2 和SLC26A4 基因突變的新生兒進行基因測序診斷，確定GJB2 基因c.235delC 純合突變2 例，GJB2 基因c.235delC/c.299delAT 復合雜合突變1 例，與篩查結果一致，同時發現4 例為GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點復合雜合突變，父母經驗證分別為相應位點突變的攜帶者。說明新生兒耳聾基因突變大部分是遺傳父母，少部分才是基因突變所致。提示在孕前、孕期進行夫妻耳聾基因篩查可以有效檢出胎兒的耳聾基因攜帶狀況，如果夫妻雙方均為同一基因攜帶者，根據耳聾的主要遺傳方式——常染色體隱性遺傳，即有1/4 可能出生聾兒，可進行婚育指導和產前診斷，以減少耳聾的出生。

從耳聾基因突變狀態與聽力篩查結果比較中發現，耳聾基因未突變，聽力初篩與復篩未通過率為0.05%，低于耳聾基因突變新生兒的1.79%，差異有統計學意義，與王川等[17]報道一致。說明新生兒耳聾基因突變攜帶與聽力篩查不通過兩者有相關性，所以通過聽力-耳聾基因聯合篩查，以確定先天性耳聾的高危人群，并對高危人群盡早聽力診斷加以確診，有利于早期采取干預，避免由聾致啞。

按照新生兒聽力篩查規范要求，常規聽力篩查未通過，初次診斷性聽力評估在3 個月左右完成，最后確診耳聾還要延后，但結合耳聾基因篩查結果，可以在出生2 個月就進入到聽力診斷的階段，盡早發現和干預患兒。本研究還對聽力篩查通過而基因測序診斷為GJB2基因c.235delC/c.109G＞A 位點復合雜合突變的新生兒進行隨訪，出生3 個月聽力均診斷正常，由于GJB2 基因c.109G＞A 位點突變外顯不全，對于GJB2 基因c.235delC/c.109G＞A 位點復合雜合突變，是否表現聽力障礙，目前各個研究者認識不一致，國內外尚無相關報道，即使出生后聽力篩查與診斷正常，但仍需要長期隨訪聽力發育，一旦發現聽力異常需及時干預。本研究對14 例攜帶線粒體12SrRNA 基因突變的新生兒進行藥物性耳聾高危用藥指導，避免用藥致聾；對18 例GJB3基因突變攜帶者和3 例雙基因雜合突變者囑其父母注意聽力發育及生活指導。

綜上所述，本研究通過聽力-耳聾基因聯合篩查與診斷，在出生3 個月確診中重度耳聾4 例，對不同的耳聾基因突變者進行個性化干預，達到了早發現、早診斷、早干預的目的。本研究為杭州地區開展新生兒聽力-耳聾基因聯合篩查提供了理論依據及基礎數據，對提高杭州地區出生人口健康素質具有積極的意義。