痰誘導涂片COPD 分型與急性加重期患者肺功能及炎癥因子的關系

蔡曉盛 陳芒芒 龔昌要 池瓊 潘景業

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）病程長，病情復雜，且易反復發作。據WHO 估計，全世界約有3.28 億COPD 患者，到2030年COPD 將成為全球第三大死亡原因[1]。炎癥細胞在肺部聚集并被激活被認為是導致COPD 慢性炎癥反應的中心環節[2-3]。近年來有學者將痰誘導涂片技術用于評估COPD 急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD）的疾病嚴重程度，并逐漸發現其在評估氣道炎癥細胞及炎癥因子中的重要性，為COPD 的診斷及治療提供了重要的參考價值[3-7]。基于誘導痰中炎癥細胞的種類及數量不同，可將AECOPD 患者分為嗜酸性粒細胞型（EOS型）、中性粒細胞型（NE 型）、粒細胞缺乏型（AGR 型）、混合粒細胞型（MIX 型）。本研究對基于痰誘導涂片的COPD 分型與AECOPD 患者肺功能指標及炎癥因子的相關性進行分析，評估不同分型患者對治療的反應性，為AECOPD 患者盡早開展個性化臨床治療及對預后評估提供參考依據。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016 年6 月至2017 年1 月溫州市中心醫院呼吸內科收治的AECOPD 患者122 例作為研究對象，其中男65 例，女57 例；身高（159.8±6.1）cm；體重（67.3±9.4）kg；年齡44～79（62.7±5.2）歲；病程5～13（8.41±1.24）年。AECOPD 診斷標準：所有患者均符合中華醫學會呼吸病學分會制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013 年修訂版）》的診斷標準[8]：患者均已確診為COPD，短期內出現急性加重，咳嗽、咳痰增多或痰液呈膿性、呼吸困難，超出日常的變異，排除心力衰竭等其他可能病因，并需要改變藥物治療。排除標準：（1）合并嚴重肝腎功能不全、內分泌系統、血液系統、風濕免疫系統疾病等患者；（2）肺癌、活動性肺結核及肺炎、嚴重支氣管擴張、支氣管哮喘患者；（3）近期嚴重外傷、手術患者；（4）無法進行痰誘導、肺功能檢測的患者及不愿參與研究的患者。本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 痰誘導及涂片染色 所有患者入院后48 h 內進行痰誘導及肺功能檢測。操作方法：（1）向患者講解痰誘導產生的不適以及痰誘導后會產生過量的黏液，誘導前將患者的基本資料（包括身高、體重）輸入電腦中，然后按照美國胸科協會指南檢測患者的肺功能指標[包括第一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）]并記錄。（2）通過儲霧罐裝置吸入沙丁胺醇2噴[規格：100 μg/支，批號：16110012/B，葛蘭素史克制藥（蘇州）有限公司]，10 min 后第2 次測量患者的肺功能指標并記錄。（3）囑患者平靜呼吸時吸入超聲霧化后的3%氯化鈉溶液7 ml，每次吸入后鼓勵患者積極咳嗽，清理鼻咽腔后收集痰液。（4）再測FEV1，若FEV1下降不超過10%則繼續操作；若FEV1下降10%～20%，則再次吸入沙丁胺醇2 噴；如果再次吸入沙丁胺醇后沒有改善則應終止試驗，如果有改善則可繼續痰誘導。（5）必要時重復以上步驟，結束誘導條件為誘導所得的標本已足夠實驗需要。（6）在30 min 內結束誘導過程，結束后復測FEV1。（7）在誘導過程中患者出現胸悶、咳嗽等不適癥狀應立即停止誘導。（8）測量痰液重量后，加入4 倍痰液重量的0.1%二硫蘇糖醇（批號：3577B051，卡邁舒上海生物科技有限公司），反復吹打，震蕩5 min 后，在37 ℃水浴15 min，經無菌紗布過濾后，1 000 r/min 離心5 min，取離心沉淀物進行細胞涂片染色。

1.2.2 AECOPD 分型標準[5]痰涂片染色后進行細胞計數、分類，共計數400 個炎癥細胞，包括中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞及巨噬細胞；同時記錄鱗狀上皮細胞，鱗狀上皮細胞比例＞80%被認為痰標本污染。標本評價：標本評分＞18 分為良好，8 分≤標本評分≤18 分為中等，標本評分＜8 分為差。痰涂片評分＞18 分可進行細胞計數分型。痰涂片評分標準見表1。依據痰樣本中嗜酸性粒細胞百分比是否＞2.5%以及中性粒細胞百分比是否＞61%，將AECOPD患者分為EOS 型（嗜酸性粒細胞百分比＞2.5%，中性粒細胞百分比≤61%）；NE 型（嗜酸性粒細胞百分比≤2.5%，中性粒細胞百分比＞61%）；AGR 型（嗜酸性粒細胞百分比≤2.5%，中性粒細胞百分比≤61%）；MIX 型（嗜酸性粒細胞百分比＞2.5%，中性粒細胞百分比＞61%）。

表1 誘導痰涂片評分標準

1.2.3 血常規及炎癥因子檢測 所有患者于入院后24 h內抽取空腹靜脈血待檢。采用全自動血細胞計數分析儀（型號：AU-680，貝克曼庫爾特生物科技蘇州有限公司）檢測血常規；采用流式細胞儀（型號：FACSCalibur，美國BD 公司）檢測血清活性氧（reactive oxygen species，ROS）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等氧化/抗氧化相關指標；采用ELISA 法檢測IL-8、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和TNF-α，嚴格按照說明書的操作步驟完成。

1.2.4 臨床治療方法及療效評價 所有患者給予靜脈滴注廣譜抗生素[阿莫西林-克拉維酸針1.2 g，1 次/8 h（規格：1.2 g/支，批號：F6125508，華北制藥股份有限公司）或哌拉西林舒巴坦鈉針4.5 g，1 次/8 h（規格：4.5 g/支，批號：161203，蘇州二葉制藥有限公司）或莫西沙星針0.4 g，1 次/d（規格：0.4 g/250 ml/瓶，批號：BXHGJU3，拜耳先靈醫藥保健股份公司）]；并予霧化吸入支氣管擴張劑。每天完成臨床COPD 問卷（clinical COPD questionnaire，CCQ）評分，并記錄患者急性加重期到恢復期（病情與加重期前的相似）的時間（癥狀恢復時間）、住院時間。療效標準[5]：有效為CCQ 評分達到恢復期；失敗為CCQ 評分未達到恢復期，規范使用抗生素7 d 后仍需要繼續使用或需要更改抗生素。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0 統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時，兩兩比較采用LSD-t 檢驗；方差不齊時，兩兩比較采用Tamhane's T2 檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson 相關分析不同分型AECOPD 患者炎癥因子水平與肺功能指標的相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AECOPD 患者分型結果 122 例AECOPD 患者中，EOS 型25 例，NE 型51 例，AGR 型35 例，MIX 型11 例。

2.2 不同分型AECOPD 患者外周血及誘導痰嗜酸性粒細胞百分比和中性粒細胞百分比比較 不同分型AECOPD 患者外周血及誘導痰嗜酸性粒細胞百分比和中性粒細胞百分比比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。進一步兩兩比較發現，NE 型及MIX 型患者外周血及誘導痰中性粒細胞百分比均高于EOS 型及AGR 型患者（均P＜0.05），而EOS 型及MIX 型患者外周血及誘導痰嗜酸性粒細胞百分比均高于NE 型及AGR 型患者（均P＜0.05），見表2。

表2 不同分型AECOPD 患者外周血及誘導痰嗜酸性粒細胞百分比和中粒細胞百分比比較（%）

2.3 不同分型AECOPD 患者肺功能指標比較 不同分型AECOPD 患者FEV1和FEV1/FVC 比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。進一步兩兩比較發現，NE型及MIX 型患者FEV1均低于EOS 型及AGR 型（均P ＜0.05），NE 型患者FEV1/FVC 均低于EOS 型、AGR 型及MIX 型（均P＜0.05），見表3。

表3 不同分型AECOPD 患者肺功能指標比較（%）

2.4 不同分型AECOPD 患者炎癥因子比較 不同分型AECOPD 患者ROS、SOD、IL-8、GM-CSF 及TNF-α比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。進一步兩兩比較發現，NE 型及MIX 型患者血清ROS、IL-8、GMCSF 及TNF-α 水平均高于EOS 型及AGR 型，血清SOD 活性均低于EOS 型及AGR 型（均P＜0.05）；且NE型患者血清ROS 水平高于MIX 型，SOD 活性低于MIX 型（均P＜0.05），見表4。

2.5 不同分型AECOPD 患者炎癥因子水平與肺功能指標的相關性分析 Pearson 相關分析顯示，不同分型AECOPD 患者血清ROS、IL-8、GM-CSF 及TNF-α 水平與FEV1及FEV1/FVC 均呈負相關（均P＜0.05），血清SOD 活性與FEV1及FEV1/FVC 均呈正相關（均P＜0.05），見表5～6。

2.6 不同分型AECOPD 患者臨床療效比較 不同分型AECOPD 患者癥狀恢復時間、住院時間和藥物治療失敗率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。進一步兩兩比較發現，NE 型及MIX 型患者癥狀恢復時間、住院時間均長于EOS 型及AGR 型，治療失敗率均高于EOS 型及AGR 型（均P＜0.05），見表7。

3 討論

COPD 發病原因或許和肺部的異常炎癥反應有關[9]。研究顯示COPD 以遍及氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥為特征，這種炎癥反應常以中性粒細胞等炎癥細胞在肺內浸潤增多為主要表現[10]；另有研究顯示，部分AECOPD 患者氣道內的嗜酸性粒細胞也升高明顯[3]，提示炎癥反應可能是導致COPD 發生的重要原因[11-12]。本研究對不同分型AECOPD 患者炎癥因子水平進行比較，結果提示AECOPD 患者中炎癥因子可能在慢性肺損傷過程中起直接或間接作用，其結果與部分學者的研究一致[13-14]。另有研究發現，炎癥因子IL-8與α1 抗胰蛋白酶可相互配合產生趨化活性，打破肺的免疫防御系統，加強炎癥反應和細菌感染，并促進COPD 的發展[15]。此外IL-8、TNF-α、GM-CSF 等還可活化中性粒細胞并釋放多種炎癥介質，產生黏膜水腫、白細胞浸潤及調節免疫反應等多種效應，同時這些炎癥因子還與氣道平滑肌增厚、氣道持續損傷及氣道重塑有關，并可能導致COPD 的發生[13-14]。本研究結果還發現氧化/抗氧化失衡在慢性肺損傷過程中也可能起到一定作用，這與倪涵晨等[16]的研究結果一致。倪涵晨等[16]認為除了炎癥外，氧化/抗氧化平衡對COPD 的發病具有重要作用，ROS 包含超氧陰離子（O2-）、過氧化氫等氧化物，具有氧化作用，可對肺組織產生氧化損傷，已有研究證實，ROS 可通過多方面途徑參與COPD 的發生、發展[17]。而SOD 可以通過清除O2-對肺組織起到保護作用[18]。由此可見，氧化/抗氧化失衡可直接損傷肺功能導致COPD 疾病的發生、發展[16]。

表4 不同分型AECOPD 患者炎癥因子比較

表5 不同分型AECOPD 患者炎癥因子水平與FEV1 的相關性分析

表6 不同分型AECOPD 患者炎癥因子水平與FEV1/FVC 的相關性分析

表7 不同分型AECOPD 患者臨床療效比較

眾所周知，盡早評估AECOPD 患者的疾病嚴重程度可為治療提供重要參考依據[19]。臨床上肺功能檢查在COPD 的診斷、病情評估、預后及治療反應等方面均有重要意義，但急性加重期檢查結果也往往不夠準確，甚至部分患者難以完成該檢查，所以該時期不建議對患者進行肺功能檢查[20]。近年來臨床上應用痰誘導涂片技術評估AECOPD 疾病嚴重程度具有一定的價值，并為COPD 的診斷及其治療提供了重要的參考價值[3-5]。該技術具有很好的準確性和可重復性，對氣道疾病的診斷和鑒別診斷、藥物療效觀察及其機制探討有一定意義[21]，這種非侵入性定量定性檢測氣道炎癥的方法安全、可靠、簡便、不受病情限制、患者易于接受[3]。本研究對痰液進行誘導后涂片染色，并根據嗜酸性粒細胞百分比和中性粒細胞百分比進行分型，對不同分型患者肺功能指標進行分析，結果提示AECOPD 患者痰誘導中性粒細胞數量升高，與疾病的嚴重程度存在一定的關系，本研究結果與部分學者的研究一致[3，5]。因此在AECOPD 期間可用痰誘導涂片技術來評估病情嚴重程度，為盡早開展臨床治療提供參考。此外，本研究對不同分型AECOPD 患者的療效觀察發現，NE 型和MIX 型患者對治療的反應性可能較差，部分患者使用抗生素需要超過7 d，對于這部分患者應盡早引起重視，盡早給予制定個性化治療方案，使患者最大獲益。

本研究優點在于屬于前瞻性研究，對臨床治療有明確的指導意義；在AECOPD 期因各種原因導致肺功能檢查缺失，可以考慮使用痰誘導涂片結果暫時代替肺功能來評估病情嚴重程度，為盡早開展臨床治療提供參考。本研究的不足之處在于樣本量較少,對最終結果的有效性產生一定影響，因此有待于擴大樣本量來進一步研究證實。

綜上所述，根據痰誘導涂片結果對AECOPD 患者進行分型，其中NE 型和MIX 型COPD 患者的肺功能較差、氧化/抗氧化系統失衡較為嚴重、對治療反應性較差。這種分型可為AECOPD 患者個性化治療方案的制定提供參考。