肝爽顆粒通過Nrf2/HO-1信號通路緩解慢性肝損傷作用及機制研究*

劉曉昆 ，王立新

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津市第二人民醫院，天津 300192）

肝臟是調節體內代謝平衡和解毒的主要器官，正是由于這些重要的作用，肝細胞極易受到藥物、化學和環境等因素的影響導致肝損傷。研究表明，氧化應激是肝細胞損傷的病理學基礎。四氯化碳（CCL4）、亞硝胺以及環磷酰胺等肝毒性藥物可通過產生過量的活性氧（ROS）誘導肝細胞氧化應激損傷[1]。

核因子E2相關因子2（Nrf2）是調控含抗氧化反應元件（ARE）的主要轉錄因子，參與轉錄調控多種抗氧化和Ⅱ期解毒酶，如：血紅素氧合酶1（HO-1）、醌氧化還原酶1（NQO1）及谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）[2-3]。通過外建立“Nrf2分級激活”小鼠模型，驗證了多種肝臟毒性物質誘導小鼠肝損傷以及氧化應激的程度與Nrf2的激活程度密切相關[4]。大量研究證實，激活Nrf2相關信號通路對于治療慢性肝病具有重要作用，鐵皮石斛[5]、右旋美托咪啶[6]均能通過激活Nrf2信號通路，保護肝細胞氧化損傷。

肝爽顆粒（GSG）是咸陽步長制藥有限公司基于中醫藥理論及多年臨床經驗總結而成的中藥復方制劑，由醋制柴胡、白芍、當歸、茯苓、炒白術、黨參、鱉甲、蒲公英、虎杖、炒枳殼、夏枯草、丹參和桃仁13味中藥組成，具有舒肝健脾、清熱散瘀、保肝護肝、軟堅散結的療效，臨床可用于治療肝炎、肝硬化及肝損傷等病癥[7]。基礎研究表明，GSG能夠通過改善大鼠肝組織中蛋白質多糖、膠原蛋白和非膠原性糖蛋白等含量，治療CCL4誘導的肝纖維化[7]。GSG中的主要成分柚皮苷通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）從而抑制肝星狀細胞的活化，最終發揮抗肝纖維化的作用[8]。GSG能抑制CCL4誘導的慢性肝損傷模型小鼠肝細胞凋亡，其機制與增強細胞自噬表達有關[9]。大量臨床研究也說明了GSG聯合其他藥物治療各種肝病療效顯著。GSG聯合多烯磷脂膽堿注射液治療慢性乙型肝炎具有較好的臨床療效[10]。慢性乙型肝炎肝纖維化患者經過GSG聯合恩替卡韋治療后，肝功能有較大程度的改善，細胞外基質代謝也明顯改善，癥狀也明顯好轉[11]。乙肝肝硬化患者接受GSG聯合恩替卡韋抗病毒治療，有利于改善患者的肝功能且有較好的耐受性[12-13]。乙型肝炎患者使用GSG聯合α干擾素治療，能提高機體的免疫力，提高患者病毒轉陰率[14]。但是GSG治療慢性肝損傷的研究較少，其機制也尚未明確。因此，本研究旨在通過腹腔注射CCL4建立慢性肝損傷小鼠模型，初步探討GSG對CCL4誘導的慢性肝損傷模型小鼠的保護作用及其潛在機制，為GSG治療慢性肝損傷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 GSG購自咸陽步長制藥有限公司；CCL4（純度≥99%）購自天津市凱通化學試劑有限公司；天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）微量蛋白檢測試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司；總核糖核酸（RNA）提取試劑盒、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預混試劑均購自天根生物科技有限公司。

1.2 實驗動物 50只BALB/c小鼠[雄性，體質量（20±2）g]購自斯貝福生物技術有限公司，動物許可證號：1100111911034967。飼養環境：室溫（22±2）℃，濕度50%±10%，光照明暗各12 h，動物自由攝食和飲水，每周更換兩次墊料。

1.3 實驗分組 適應性喂養3 d后，將50只BALB/c小鼠分為正常組（10只）和模型組（40只）。正常組腹腔注射橄欖油（2 mL/kg），模型組腹腔注射20% CCL4橄欖油溶液（2 mL/kg），每周 2次，持續6周[15]。成功造模后將40只模型小鼠分為模型組、GSG低劑量組、GSG中劑量組、GSG高劑量組。對照組與模型組灌胃生理鹽水，每日10 mL/kg，GSG低、中、高劑量組每日灌服GSG水溶液1、2、4 g/kg，連續 4 周[7-8]。

1.4 小鼠的一般情況及肝指數 造模給藥期間觀察小鼠的毛色及生活狀況，隔日稱量小鼠的體質量。末次給藥后，小鼠禁食12 h，麻醉、稱量小鼠體質量后脫頸處死小鼠，取各組小鼠的肝組織，于生理鹽水中清洗干凈后用濾紙充分吸干水分，稱質量，計算小鼠的肝指數。肝指數（%）=肝質量（g）/體質量（g）×100%[16]。

1.5 血清生化指標檢測 目內眥取血后，離心（3 500 r/min，15 min，離心半徑 15.9 cm）收集血清，試劑盒檢測各組小鼠血清中AST、ALT水平。

1.6 肝組織病理檢查 取各組小鼠的肝組織，4%甲醛溶液固定，經脫水、包埋、切片等處理后，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡觀察肝組織的病理學特征。

1.7 肝組織生化指標檢測 稱取100 mg肝組織，加入900 μL預冷的生理鹽水（質量體積比為1∶9），冰上勻漿制作10%的肝組織勻漿，離心（4 000 r/min，10 min，離心半徑15.9 cm），取上清BCA測定肝組織勻漿中蛋白含量、SOD、GSH-Px和MDA水平。

1.8 熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）檢測 造模給藥后，取各組小鼠的肝組織，提取肝組織中的總RNA，反轉錄合成cDNA，試劑盒擴增，qPCR法檢測小鼠肝臟組織中 Nrf2、HO-1、GCLC和 NQO1的mRNA相對表達水平，GAPDH為內參。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 統計學方法 利用SPSS 23.0軟件進行統計分析，實驗數據用均數±標準差（±s）表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 GSG對CCL4誘導的慢性肝損傷小鼠的治療作用 通過計算各組小鼠的肝指數，筆者發現模型組小鼠肝指數與正常組相比升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，GSG低劑量組肝指數無統計學差異（P＞0.05），但GSG中、高劑量組肝指數顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組小鼠血清AST和ALT活性均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05或 P＜0.01），說明模型組小鼠肝損傷明顯；與模型組比較，GSG低劑量組AST與ALT水平差異無統計學意義（P＞0.05），而GSG中、高AST和ALT活性顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05或 P＜0.01），說明 GSG 能顯著改善CCL4所誘導的肝損傷。見表2。

表2 GSG對慢性肝損傷小鼠肝指數、AST、ALT的影響（±s）

表2 GSG對慢性肝損傷小鼠肝指數、AST、ALT的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數 肝指數（%） AST（U/L） ALT（U/L）正常組 10 4.52±0.22 73.05±8.87 32.32±4.26模型組 10 6.29±0.46** 152.96±16.81** 69.63±27.45*GSG 低劑量組 10 5.92±0.44 137.92±43.52 47.06±10.79 GSG 中劑量組 10 5.77±0.19# 101.21±18.47## 39.20±5.63#GSG 高劑量組 10 5.66±0.53# 56.37±15.55## 34.72±11.78#

造模后，觀察各組小鼠肝組織HE染色結果，發現正常組小鼠肝組織結構清晰，細胞核清晰，胞質完整。模型組小鼠肝組織有廣泛的組織學改變，表現為肝細胞嚴重水腫呈氣泡樣變，肝細胞核碎裂壞死，肝索解離。GSG低劑量組肝細胞嚴重水腫，而GSG中、高劑量組肝細胞水腫與壞死情況較模型組減輕，說明GSG能減輕肝損傷程度。見圖1。

圖1 小鼠肝組織HE染色（×200）

2.2 GSG對慢性肝損傷小鼠肝組織氧化損傷的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01），說明CCL4誘導慢性肝損傷模型小鼠的肝組織氧化損傷明顯。與模型組比較，GSG低、中、高劑量組能明顯升高肝組織中SOD和GSH-Px活性（P＜0.05或 P＜0.01），降低 MDA 含量（P＜0.05或P＜0.01）。見表 3。

表3 GSG對慢性肝損傷小鼠SOD、GSH-Px及MDA的影響（±s）

表3 GSG對慢性肝損傷小鼠SOD、GSH-Px及MDA的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數 SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mgprot）MDA（nmol/mgprot）正常組 10 318.67±6.44 366.65±17.27 19.66±1.58模型組 10 232.41±5.06* 295.11±12.20* 29.36±3.28*GSG 低劑量組 10 242.13±2.84## 278.77±22.38 24.30±3.67#GSG 中劑量組 10 249.43±7.99## 317.53±19.31# 24.53±2.67#GSG 高劑量組 10 304.61±15.28## 341.13±19.46## 19.60±1.74##

2.3 GSG對慢性肝損傷小鼠氧化應激相關基因表達的影響 為了探究GSG是否通過調節Nrf2/HO-1通路發揮抗氧化作用，課題組檢測了各組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、GCLC和 NQO1基因的mRNA表達水平。結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠Nrf2、HO-1、Gclc和NQO1的mRNA表達明顯下調（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，除GSG低劑量組HO-1 mRNA和GSG中劑量組GCLC mRNA表達水平無統計學意義外，其余GSG低、中、高劑量組Nrf2、HO-1、Gclc和 NQO1的表達均上調（P＜0.05或P＜0.01）。見圖 2。

圖2 造模給藥后各組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、GCLC和 NQO1 mRNA 相對表達量（±s，n=6）

3 討論

研究表明，P450酶系統代謝CCl4產生代謝產物三氯甲基自由基與三氯甲基過氧自由基引發脂質過氧化，ROS過量產生引發氧化應激，導致肝細胞損傷[17]。ALT和AST是催化氨基酸和酮酸之間氨基轉移的酶，主要存在于肝細胞中。肝細胞受損或凋亡時會釋放AST和ALT入血，因此，血清AST、ALT水平能反映肝功能受損的情況和程度[16]。本研究采用CCL4建立慢性肝損傷模型小鼠發現，模型組小鼠血清中AST和ALT水平與正常組相比均顯著升高，并且HE染色結果顯示肝細胞大量水腫、部分肝細胞壞死，說明本研究造模成功。本研究發現GSG各劑量組能降低CCL4誘導的慢性肝損傷模型小鼠血清中AST、ALT活性并一定程度上緩解肝細胞水腫和壞死，說明GSG對CCL4所誘導的慢性肝損傷模型小鼠有一定的保護作用。

SOD是機體對抗氧化應激的第一道防線，是清除體內超氧陰離子的專一性抗氧化酶，能催化超氧自由基轉化為過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2）[18-19]。GSH是一種內源性抗氧化劑，可以催化過氧化物還原，保護細胞免受氧化應激損傷[19-20]。MDA是脂質過氧化的終產物。因此，檢測肝組織中SOD、GSH-Px和MDA的活性，能一定程度反映肝臟氧化損傷的程度。本研究結果顯示，經CCL4誘導的慢性肝損傷模型小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性顯著降低，MDA水平顯著升高。而給予GSG灌胃處理后，肝組織中SOD、GSH-Px活性又顯著升高，同時MDA水平明顯下降，表明GSG對CCL4誘導的慢性肝損傷模型小鼠肝組織的氧化損傷有一定保護作用。

氧化應激是肝損傷發生發展的重要機制之一，因此，調節肝臟氧化應激是治療肝臟疾病的重要途徑。Nrf2是一種氧化應激介導的轉錄因子，能調節多種細胞，包括肝細胞的氧化應激損傷[21]。正常情況下，Nrf2與負調節因子kelch樣的ech相關蛋白1（Keap1）在細胞質中形成復合體，而在氧化應激情況下，Nrf2磷酸化并從Nrf2-Keap1復合體中解離，轉位進入細胞核中，誘導HO-1、NQO1、GCLC等下游基因釋放，發揮抗氧化作用，從而保護肝細胞[22]。HO-1是血紅素分解代謝的限速酶，能催化血紅素氧化降解為膽綠素，膽綠素隨后被膽紅素還原酶轉化為膽紅素，膽紅素具有抗補體作用，可保護細胞免受補體激活介導的炎癥和氧化損傷反應[23-24]。GCLC是肝臟中生物合成的限速酶[25]。NQO1具有清除超氧化物的能力，能夠保護肝細胞不受氧化應激損傷[19]。本研究檢測Nrf2及其關鍵抗氧化酶顯示，GSG能激活Nrf2、HO-1及其下游GCLC和 NQO1的mRNA表達從而發揮抗氧化作用，提示GSG可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路緩解慢性肝損傷模型小鼠的氧化應激損傷發揮治療作用。

綜上所述，本研究結果說明了GSG能激活Nrf2、HO-1、NQO1及GCLC，從而抑制氧化應激反應，提示GSG可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路緩解CCL4誘導的慢性肝損傷模型小鼠的肝功能受損，為臨床GSG治療慢性肝損傷提供了理論依據。