GDF11對糖尿病小鼠骨髓間充質干細胞細胞凋亡的影響及其信號機制

翟 羽，吳方麗，田蕭羽，李 爽，郭樹琴，朱 彪，趙立升，郭紅延

隨著我國經濟的高速發展、生活方式西方化和人口老齡化，2型糖尿病患病率和發病率急劇上升[1]。2型糖尿病是口腔種植術的相對禁忌證，其中一個重要原因就是高血糖所致的晚期糖基化終末產物聚集導致骨髓間充質干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)凋亡[2]。文獻[3]報道，生長分化因子11(growth differentiation factor 11, GDF11)能緩解2型糖尿病小鼠的胰島素抵抗，改善胰腺β細胞功能并減少β細胞凋亡[4]。而且，GDF11對2型糖尿病小鼠的這些有益作用是通過激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)信號通路實現的[3-5]。但是，GDF11對2型糖尿病小鼠BMSCs細胞凋亡的影響及相關信號機制尚不清楚。因此，本課題以體外培養的2型糖尿病小鼠BMSCs為研究對象，探討GDF11對2型糖尿病小鼠BMSCs細胞凋亡的影響及其信號機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器 正常小鼠與糖尿病小鼠BMSCs(解放軍總醫院轉化醫學中心實驗室)，重組人GDF11蛋白(北京百奧萊博)，PI3K特異性抑制劑LY294002(美國Selleck)，α-MEM培養液、胎牛血清(美國Gibco)，胰酶、臺盼藍、青霉素及鏈霉素(美國Sigma)，兔抗人PI3K抗體、磷酸化PI3K(p-PI3K)抗體、兔抗鼠Akt抗體、p-Akt抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體及山羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology)；BCA(bicinchoninic acid)測定試劑盒(武漢博士德)；PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美國Millipore)。

Herocell C1型CO2恒溫培養箱(中國潤度生物)；BCM-1000A型生物凈化工作臺(蘇州安泰)；5702R型低速離心機、Biophotometer核酸蛋白測定儀(德國eppendorf)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉膜儀(北京六一儀器廠)；LW300LFT型正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2 細胞分組 實驗分組：正常小鼠BMSCs組(normal; Nor)，糖尿病小鼠BMSCs組(diabetes; DB)，GDF11干預組(DB+GDF11; GDF11)和PI3K/Akt信號通路抑制劑組(DB+GDF11+LY294002；LY)。復蘇細胞庫凍存的BMSCs，采用含10%胎牛血清的α-MEM培養液培養1 d后，全換液。加藥后繼續培養3 d進行后續實驗，加藥順序：加入50 μM的LY294002[6]培養30 min后，加入30 g/ml GDF11[7](未標明加藥的組別不處理)。

1.3 細胞凋亡率 取各組細胞，0.5%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液。然后，采用濃度為0.4%的臺盼藍染液進行染色。9滴單細胞懸液加1滴臺盼藍染液混勻后鋪板，細胞計數儀檢測各組細胞的凋亡率。細胞凋亡率(%)=著色細胞/總細胞×100%。

1.4 Western blot檢測相關蛋白的表達 取各組細胞，PBS緩沖液沖洗3遍，然后加入細胞裂解液裂解細胞并提取總蛋白。測定總蛋白濃度后，各取50 μg總蛋白，上樣后進行凝膠電泳。電泳后在220 mA, 2 h的條件下轉膜于0.2 μm的PVDF膜，室溫封閉2 h，分別滴加特異性一抗封閉過夜，再以辣根過氧化物酶標記的二抗封閉2 h。最后，用化學發光劑染色、顯影并采用Image J軟件分析膠片灰度。所有實驗至少重復3次。

2 結 果

2.1 GDF11對糖尿病小鼠BMSCs細胞凋亡率的影響 與正常小鼠BMSCs[(3.1±1.1)%]相比，糖尿病小鼠細胞BMSCs(DB組)凋亡率明顯升高[(36.2±3.3)%，P<0.05]，而GDF11干預(GDF11組)顯著降低(18.9±1.9)%vs.(36.2±3.3)%，P<0.05]。當加入PI3K特異性抑制劑LY294002后(LY組)，GDF11降低凋亡率的作用顯著升高[(41.1±3.9)%vs.(18.9±1.9)%，P<0.05]。

2.2 GDF11對糖尿病小鼠BMSCs凋亡相關蛋白表達的影響 如圖1與表1所示，與正常小鼠BMSCs(Nor組)相比，糖尿病小鼠細胞BMSCs(DB組)抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的表達比(Bcl-2/Bax)明顯降低，而GDF11干預(GDF11組)顯著升高Bcl-2/Bax蛋白表達比。當加入PI3K特異性抑制劑LY294002后(LY組)，GDF11升高Bcl-2/Bax的作用顯著降低。

圖1 各組細胞凋亡相關蛋白的表達

表1 各組細胞凋亡蛋白相對表達量

2.3 GDF11對PI3K/Akt信號通路的影響 與Nor組相比，糖尿病小鼠BMSCs細胞(DB組)p-PI3K和p-Akt的表達水平均顯著降低，而GDF11干預(GDF11組)顯著升高p-PI3K和p-Akt的表達水平，激活PI3K/Akt信號通路。而且，GDF11激活PI3K/Akt信號通路的作用可被LY294002阻斷(LY組)，p-PI3K和p-Akt的表達水平均顯著降低(圖2與表2)。

圖2 GDF11對PI3K/Akt信號通路的影響

表2 各組細胞PI3K和Akt的磷酸化水平

3 討 論

本研究以糖尿病小鼠BMSCs為研究對象，發現GDF11能降低糖尿病小鼠BMSCs細胞凋亡率，降低促凋亡蛋白Bax的表達并提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，并且GDF11的這些作用與激活PI3K/Akt信號通路有關。

細胞凋亡是在特定的信號誘導下，細胞內級聯反應被觸發所致的生理性或病理性的主動死亡過程[8]。線粒體在內源性細胞凋亡調控中居于重要地位，許多Bcl-2家族成員如Bcl-2、Bax等都定位于線粒體膜上[9]。Bcl-2通過阻止細胞色素C從線粒體釋放來抑制凋亡；而Bax通過與線粒體上的膜通道結合促使細胞色素C的釋放來促進凋亡[10]。由于Bcl-2能防止或延遲由γ射線、糖皮質激素、熱休克和多種化療藥物所致的細胞凋亡，因此Bcl-2蛋白也被稱作“存活蛋白”[11]，而Bax是“凋亡蛋白”。本研究發現GDF11既能促進糖尿病小鼠BMSCs細胞Bcl-2蛋白的表達又能降低Bax蛋白的表達，即升高Bcl-2與Bax蛋白的表達比例，從而發揮抑制糖尿病小鼠BMSCs細胞凋亡的作用。

PI3K/Akt信號通路在細胞生長、增殖、代謝、凋亡和遷移等多種生物過程中發揮重要作用[12-14]。文獻[15]報道稱，激活PI3K/Akt信號通路能通過減少促凋亡蛋白caspase 3、caspase 9、Bax和升高抗凋亡蛋白Bcl-2減緩細胞凋亡。本研究發現，GDF11不僅能提高糖尿病小鼠BMSCs細胞Bcl-2與Bax蛋白的表達比例，而且能激活PI3K/Akt信號通路。最重要的是，當加入PI3K特異性抑制劑LY294002后，GDF11升高Bcl-2與Bax蛋白的表達比例的作用明顯減弱，而且細胞凋亡也顯著上升，這從反面證實GDF11降低糖尿病小鼠BMSCs細胞凋亡的作用至少在某種程度上與激活PI3K/Akt信號通路有關。如果同時使用Akt抑制檢測GDF11對糖尿病小鼠BMSCs細胞凋亡的影響，可以更完整地證明PI3K/Akt信號通路的重要作用，這是本文的一個局限。與我們的研究相似，文獻[16]報道，石斛酚抑制大鼠BMSCs細胞凋亡的作用也是通過激活PI3K/Akt信號通路實現的。

綜上所述，本研究發現GDF11可在體外抑制糖尿病小鼠BMSCs細胞凋亡，并且GDF11的這種作用與激活PI3K/Akt信號通路有關。GDF11有望被開發成抑制BMSCs細胞凋亡，進而緩解糖尿病患者種植術區骨量不足的一種新型藥物。