武警某部醫(yī)院碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥基因分析

張 梅，謝祥紅，魏文波，張 欣，鄒 艷，何艷紅，鄧 勇

近年來，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(carbapenem-resistant enterobacteriaceae，CRE)的檢出率在全球范圍內(nèi)呈逐年增高趨勢，給社會公共健康領域帶來嚴重威脅[1]。自2017年以來，武警四川總隊醫(yī)院CRE比例明顯升高。本研究其中碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenemresistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)比例升高尤為突出。全國范圍已有較多CRKP耐藥基因的研究報道，而本院尚缺乏相關的研究資料。為了解武警四川總隊醫(yī)院CRKP耐藥情況和耐藥基因分布，收集武警四川總隊醫(yī)院2017-08至2020-03臨床分離的CRKP，用改良碳青霉烯滅活實驗(mCIM)和酶抑制劑增強試驗聯(lián)合檢測CRKP的碳青霉烯酶表型情況，用GeneXpert對常見耐藥基因進行檢測，以了解我院CRKP流行情況，為臨床CRKP感染治療和醫(yī)院感染防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 武警四川總隊醫(yī)院2017-8至2020-03臨床分離的CRKP 32株，剔除同一患者重復菌株。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922，大腸埃希菌ATCC35218，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706，均由四川省臨床檢驗中心饋贈。

1.2 儀器及試劑 細菌的鑒定和藥敏用美國貝克曼公司Microscan.Walk Away96全自動細菌鑒定藥敏分析儀。藥敏折點嚴格按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2017版判斷,頭孢哌酮/舒巴坦折點按肝桿菌科頭孢哌酮折點，替加環(huán)素折點按FDA標準判斷。藥敏紙片購自溫州康泰生物科技有限公司。酶抑制劑增強試驗購自上海原科實業(yè)發(fā)展有限公司。耐藥基因檢測采用美國塞佩公司Gene-Xpert Carba-ⅩⅤⅠR2全自動病原體快速檢測系統(tǒng)。

1.3 mCIM試驗 用1 μl接種環(huán)取血平板上過夜孵育的待測菌滿環(huán)接種至2 ml TSB中，漩渦震蕩10～15 s后加入一張10 μg美羅培南紙片，35 ℃孵育4 h后，用10 μl接種環(huán)取出美羅培南紙片貼于已涂布0.5麥氏濁度ATCC25922的MH平板表面，35 ℃孵育18～24 h，量取抑菌圈直徑。抑菌圈直徑6～15 mm或抑菌圈直徑16～18 mm但抑菌圈內(nèi)有針尖樣菌落的為mCIM試驗陽性結(jié)果；抑菌圈直徑≥19 mm且抑菌圈清晰為陰性結(jié)果；抑菌圈直徑16～18 mm或抑菌圈直徑≥19 mm但抑菌圈內(nèi)有針尖樣菌落的為不確定結(jié)果。陽性結(jié)果表示檢測出碳青霉烯酶；陰性結(jié)果表示未檢測出碳青霉烯酶；不確定結(jié)果表示無法判斷是否存在碳青霉烯酶。

1.4 酶抑制劑增強試驗 將mCIM試驗陽性菌株, 配置成0.5麥氏單位菌懸液涂布于MH平板，貼上亞胺培南紙片4張，分別編號為A、B、C、D。抑菌圈A為只貼亞胺培南紙片；抑菌圈B為貼亞胺培南紙片后滴加乙二胺四乙酸(EDTA)10 μl；抑菌圈C為貼亞胺培南紙片后滴加3-氨基苯硼酸(APB)10 μl；抑菌圈D為貼亞胺培南紙片后同時滴加EDTA和APB各10 μl；35 ℃孵育18～24 h后判讀結(jié)果。當抑菌圈B和抑菌圈A差值≥5 mm時判斷該菌產(chǎn)B類金屬β-內(nèi)酰胺酶；當抑菌C和抑菌圈A差值≥5 mm時判斷該菌產(chǎn)A類絲氨酸酶碳青霉烯酶；當抑菌圈B或C無明顯擴大，但抑菌圈D與抑菌圈A差值≥5 mm時判斷該菌同時產(chǎn)A類絲氨酸酶碳青霉烯酶和B類金屬β-內(nèi)酰胺酶[1]。

1.5 GeneXpert檢測耐藥基因 將待檢菌35 ℃血平板孵育16～24 h后，挑取菌落配置成0.5麥氏單位菌懸液。吸取10 μl加至樣本處理液，漩渦震蕩10 S后吸取1.7 ml混合液加入試劑盒內(nèi)。用含有Xpert Carba-R的試劑盒將菌株在Cepheid GeneXpertⅩⅤⅠR2系統(tǒng)上進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 菌株信息 32株CRKP來自于全院13個病區(qū)。分別是重癥病區(qū)(10例)、肝膽病區(qū)(3例)、泌尿病區(qū)(3例)、呼吸病區(qū)(3例)、腦外病區(qū)(3例)、普外病區(qū)(2例)、燒傷病區(qū)(2例)、感染病區(qū)(2例)、神內(nèi)病區(qū)(1例)、外四病區(qū)(1例)、消化病區(qū)(1例)、婦科病區(qū)(1例)。

2.2 病原菌藥敏結(jié)果 32株CRKP對常用抗菌藥物氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢西丁、厄他培南、呋喃妥因耐藥率100%；對頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、美洛培南、環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星耐藥率>90%；對慶大霉素、妥布霉素耐藥率為84.4%；對阿米卡星耐藥率為75%；對復方新諾明耐藥率為46.9%；對替加環(huán)素無耐藥株(表1)。

2.3 mCIM試驗 mCIM試驗結(jié)果陽性30株，陰性2株，陽性率為93.8%。

2.4 酶抑制劑增強試驗 將30株mCIM試驗結(jié)果陽性的菌株做酶抑制劑增強試驗。結(jié)果：1株肺炎克雷伯菌產(chǎn)A類絲氨酸酶加B類金屬β-內(nèi)酰胺酶(圖1)，其余29株產(chǎn)A類絲氨酸酶(圖2)。

2.5 GeneXpert檢測耐藥基因 將30株mCIM試驗結(jié)果陽性的菌株進行KPC、IMP、VIM、NDM-1、OX-48,5種基因檢測。結(jié)果：1株肺炎克雷伯菌產(chǎn)KPC+NDM(圖3)，其余29株均產(chǎn)KPC(圖4)，沒有產(chǎn)IMP,VIM,OX-48的菌株。

圖3 武警四川總隊醫(yī)院肺炎之雷伯菌Gene Xpert檢測結(jié)果(KPC+NDM)

圖4 武警四川總隊醫(yī)院肺炎之雷伯菌Gene Xpert檢測結(jié)果(KPC)

3 討 論

肺炎克雷伯菌是臨床常見條件致病菌之一。近年來，中國細菌耐藥監(jiān)測(CHINET)顯示，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥率逐年增高。我院耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示本院CRKP自2017年來也是處于較高水平。此次研究的32株CRKP,對碳青霉烯類、頭孢類、頭霉素類、單環(huán)類、喹諾酮類、氨基糖苷類等抗菌藥物均表現(xiàn)出較高耐藥性，僅復方新諾明耐藥率46.9%、替加環(huán)素耐藥率為0。臨床單藥治療CRKP較為困難，且本院耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)2019年第4季度顯示部分CRKP菌株對替加環(huán)素MIC值有升高現(xiàn)象：之前數(shù)據(jù)一直為最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)<2，現(xiàn)已出現(xiàn)MIC=2的菌株。有研究提示，對CRKP多種抗生素聯(lián)合用藥不但可以提高藥物抗菌效果，而且也可以降低用藥劑量[2]。所以對于CRKP治療推薦臨床采用多種抗生素聯(lián)合用藥。同時實驗室應積極與臨床溝通，開展可能敏感的抗菌藥物如多黏菌素、磷霉素、頭孢他啶/阿維巴坦的藥敏試驗和聯(lián)合藥敏試驗。

此次研究菌株來自本院13個科室。科室分布廣，分離自重癥監(jiān)護病區(qū)比例較高。研究提示我院CRKP以產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶為主。這與國內(nèi)流行情況基本一致[3-5]。KPC型碳青霉烯酶基因位于可移動質(zhì)粒上[6]。攜帶KPC酶的耐藥質(zhì)粒可在不同菌株間傳播，極易發(fā)生院內(nèi)爆發(fā)流行。應提醒相關科室及醫(yī)院感染管控部門高度重視，防止局部暴發(fā)流行。

用Ambler分子分類法根據(jù)氨基酸序列的相似性把β-內(nèi)酰胺酶分為4類(A、B、C、D)，其中A、B、D類中存在能水解碳青霉烯類的酶，因此被稱為碳青霉烯酶[7-8]。腸桿菌科細菌中的碳青霉烯酶主要是A類酶(KPC、IMI、SME、GES、NMC、SHV),B類酶(NDM、IMP、VIM、GIM、SPM)，D類酶(OXA-48)[9]。其中A,D為絲氨酸酶，B為金屬酶。康蓓佩等報道提示CLSI推薦的mCIM試驗聯(lián)合EDTA改良碳青霉烯滅活試驗(eCIM)，對于同時產(chǎn)絲氨酸酶和金屬酶的菌株，mCIM陽性eCIM陰性，結(jié)果與僅產(chǎn)絲氨酸酶菌株相同[5]。王永紅等[10]報道，隨著共同表達A類和B類碳青霉烯酶菌株分離率的增加，eCIM篩選金屬酶的靈敏度會降低，而錯誤指導碳青霉烯酶抑制劑藥物種類的選擇。本研究30株mCIM陽性株中，酶抑制劑增強試驗結(jié)果1株肺炎克雷伯菌產(chǎn)A類絲氨酸酶加B類β-內(nèi)酰胺酶，其余29株產(chǎn)A類絲氨酸酶。GeneXpert法檢測耐藥基因結(jié)果1株肺炎克雷伯菌產(chǎn)KPC+NDM，其余29株均產(chǎn)KPC，酶型檢測和基因檢測完全符合。所以對于沒有條件進行耐藥基因檢測的基層單位，mCIM試驗協(xié)同酶抑制劑增強試驗檢測CRKP酶型能夠滿足臨床需要。

本研究32株CRKP中,有2株mCIM試驗陰性，表示未檢測出碳青霉烯酶。本次沒有對其進行進一步研究。可能與細菌外膜蛋白缺失或表達下調(diào)，合并產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)、頭孢菌素酶(AMPC)等耐藥機制有關。

綜上所述，我院CRKP對常用抗菌藥物耐藥率較高，耐藥機制主要為產(chǎn)碳青霉烯酶，且以產(chǎn)KPC型為主。實驗室開展對CRE耐藥酶型檢測可有效指導臨床治療并為院感防控提供依據(jù)。