LC-MS/MS法測定跌打酒中9種成分及主成分分析

藍曉慶，韋瑀龍，陸蘭娟

0 引言

跌打酒是廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院的院內制劑，由制馬錢子、大黃、三七、續斷、乳香、沒藥、蘇木、澤蘭、土鱉蟲、自然銅、無名異等十多味中藥所組成，具有活血止痛，通絡化瘀的功效，臨床觀察研究表明[1-3]，該藥用于跌打損傷，關節疼痛，四肢麻木等癥療效顯著。方中馬錢子通絡止痛，散結消腫，具有鎮痛、促進骨折愈合、修復軟骨損傷和抗骨質增生的藥理作用[4]；大黃涼血解毒，逐瘀通經，《神農本草經》有言：本品主下瘀血、血閉、寒熱、破癥瘕積聚；三七散瘀止血，消腫定痛，以上三者均為跌打損傷的常用要藥。

本研究嘗試采用液質聯用色譜法在同一色譜質譜條件下測定跌打酒中來源于馬錢子(馬錢子堿和士的寧)、大黃(大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素甲醚)和三七(三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1)的9種成分，并進行主成分分析，經查閱文獻未見有上述9個成分同時測定方法的報道，本方法的開發建立可為跌打酒或類似制劑的質量控制和評價提供參考。

1 儀器與試藥

超聲波清洗機(VGT-2227QTD，廣東固特超聲股份有限公司)，電子分析天平(GR-202，日本)，高效液相色譜-串聯質譜儀(LC-MS TripleQuad 3500)；馬錢子堿(批號：MUST-17041906)、士的寧(批號：MUST-17053001)對照品購于成都曼思特生物科技有限公司；大黃酸(批號：0757-200206)、大黃酚(批號：110796-200412)、大黃素(批號：110756-200110)、大黃素甲醚(批號：110704-200420)、三七皂苷R1(批號：110745-200415)、人參皂苷Rb1(批號：110704-200420)、人參皂苷Rg1(批號：110703-201731)對照品購于中國食品藥品檢定研究院，甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件 色譜條件：色譜柱kinetex C18(50 mm × 3 mm，2.6 μm)；流動相為0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～1.0 min,90.0%A;1.0～1.5 min,90.0%～80.0%A;1.5～5.0 min,80.0%～55.0%A;5.0～7.0 min,55.0%～8.0%A;7.0～9.0 min,8.0%A;9.0～9.1 min,8.0%～90.0%A;9.1～11.0 min,90.0%A)；流速0.35 ml/min，柱溫35 ℃；進樣量10 μl。質譜條件：離子源為ESI；檢測模式：正、負離子模式；掃描方式：多反應監測(MRM)；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：500.0 ℃。質譜參數見表1。

表1 9種成分的質譜參數[5-7]

圖1 9種成分的提取離子流色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 精密稱取馬錢子堿、士的寧、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對照品適量，分別置10 ml量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，分別得到濃度為1.0 mg/ml的對照品貯備液。再分別精密量取對照品貯備液適量，以甲醇依次稀釋成濃度為100 μg/ml，10 μg/ml，1 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 精密吸取馬錢子堿、士的寧、三七皂苷R1對照品溶液適量至25 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得含馬錢子堿、士的寧、三七皂苷R1均為1 μg/ml的混合對照品溶液A。

2.2.3 精密吸取大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對照品溶液適量至25 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，得含大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1均為1 μg/ml的混合對照品溶液B。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚供試品溶液 精密量取跌打酒1.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 馬錢子堿、士的寧、三七皂苷R1供試品溶液 精密量取“2.3.1”項的供試品溶液10.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1供試品溶液 精密量取“2.3.1”項的供試品溶液1.0 ml，至50 ml量瓶中，加甲醇-水(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 線性關系 精密吸取混合對照品溶液A適量，甲醇-水(1∶1)稀釋成對照品濃度為80、100、150、200、400、600、800 ng/ml系列梯度，在“2.1”項下條件下進樣測定；精密吸取混合對照品溶液B適量，甲醇-水(1∶1)稀釋成對照品濃度為20、50、80、100、150、200、400 ng/ml系列梯度，在“2.1”項下條件下進樣測定。上述測定結果以濃度(ng/ml)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行回歸，結果見表2。

表2 各成分的線性回歸方程

2.5 重復性試驗 取同一批樣品，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，進樣，測峰面積，結果見表3。

2.6 精密度試驗 取混合對照品溶液A、B，分別連續進樣6次，測定峰面積，結果見表3。

2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12 h進樣，測定峰面積，結果見表3。

表3 重復性、精密度、穩定性試驗結果

結果表明，測定方法的重復性和儀器精密度良好，且供試品溶液在12 h內是穩定的。

2.8 加樣回收率試驗 精密吸取同一已知含量的樣品0.5 ml，按表4供試品溶液制備方法分別制備各成分加樣回收試驗用供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣測定，計算回收率及RSD值，結果見表5。

表4 加樣回收供試液制備

表5 加樣回收試驗結果

2.9 樣品測定

取10批跌打酒樣品，按“2.3”項下方法分別平行制備供試品2份，在“2.1”項下條件進樣測定，計算各成分含量，結果見表6。

表6 10批樣品的測定結果(μg/ml)

2.10 主成分分析 以SPSS 19.0 對上述測定的9個成分進行主成分分析，計算其特征值和方差貢獻率，以特征值>1為標準，得出前三個主成分因子特征值分別為4.125、2.435、1.280，是評價跌打酒質量的主要影響因子，三個主成分因子的方差貢獻率為87.106%，結果見表7。

表7 主成分因子的特征值及方差貢獻率

表8 旋轉后的主因子載荷矩陣表

表9 10批樣品的主成分因子綜合得分及排序

3 討論

中藥制劑尤其是復方制劑成分復雜，采用單一成分的含量評價制劑質量有所欠缺，而采用高效液相色譜法測定多個成分雖較易于普及，但耗時較長，且部分成分因結構性質差異較大，在同一色譜條件下的分離度不甚理想，而液質聯用色譜法能進一步通過提取相應成分的特征離子流，所以其定性與定量受樣品色譜分離度的影響不大。

前期試驗考察以0.1%甲酸水溶液-甲醇為流動相，人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1色譜峰響應低、干擾大，改成0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇后，不僅能有效改善人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1色譜行為，同時不影響其他成分的檢測。

從主成分分析結果來看，測定的10批樣品中，前期生產的6個批次中部分成分含量的批間波動較大，而后期生產的4個批次(即20171121、20180228、20180825、20190114)批間成分含量差異小，且整體質量更好，這可能與近年來國家加強對中藥飲片的監管有關，使得購進的原料質量有所保障，進而保證了產品質量。