特發性肺纖維化代謝組學研究進展

潘婷鈺 何海浪 周賢梅

南京中醫藥大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科210029

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性進行性疾病,以纖維化、呼吸困難、肺功能惡化和生活質量降低為特征[1]。患者確診年齡通常在60歲以上[2],預后不佳；生存期中位數為3～4年,5年生存率為20%～40%[3]。呼吸衰竭是最常見的死亡原因[4]。IPF是由肺泡上皮細胞重復損傷、肌成纖維細胞不可控增殖、細胞外基質沉積等修復過程失調所致；然而,IPF的致病途徑尚未完全闡明[5-6]。IPF的診斷可以基于病史和特殊的高分辨率CT表現,主要為雙肺基底部胸膜下蜂窩影伴牽拉性支氣管擴張。當高分辨率CT僅顯示部分特征與IPF一致時,國際指南推薦外科肺活檢[2,7]。侵入性手術對于呼吸道受損的患者有一定風險,因此迫切需要侵入性較小的方法來促進診斷、評估預后和監測治療策略的有效性。

IPF導致體內病理生理過程變化,可引起代謝產物發生相應改變。代謝組學是研究生物體系(細胞、組織或生物體)受刺激或擾動后代謝組變化的科學,最常用技術是核磁共振和高分辨率質譜[8-9]。代謝組是指參與新陳代謝、維持生物體正常生長功能和生長發育的所有內源小分子(＜1 000),如氨基酸、肽、碳水化合物、脂類、核酸[10]。公共人類代謝組數據庫已建立,目前列出了42 000種代謝物[11],部分內源性小分子化合物的生化代謝網絡已經比較清楚。近年來,關于IPF代謝組學的研究報道逐漸增多。廣泛的生物樣本已用于肺部疾病代謝組學研究,包括尿液、血漿、血清、腦脊液、呼氣冷凝液、支氣管肺泡灌洗液、唾液、完整組織、細胞及其提取物[12]。這些為IPF發病機制的研究、生物標志物的篩選及藥物作用靶點的發現提供了新的研究工具,使臨床醫師將代謝組學作為IPF疾病診斷、預后評估、治療方案選擇的整體方法的一部分成為可能。現就IPF代謝組學相關研究進展予以綜述。

1 與發病機制可能相關的代謝組

1.1 鞘磷脂 鞘磷脂是質膜的組成部分,并與細胞增殖途徑相聯系,可能與IPF的肺結構重建有關。Zhao等[13]通過對8例IPF患者與8名健康受試者肺組織的質譜檢測,發現與對照組相比,IPF患者肺中的代謝物二氫鞘氨醇、鞘氨醇、鞘磷脂水平降低,微陣列數據顯示IPF組SMPD1、SMPD4和DEGS1表達下調,表明神經酰胺的產生受到破壞,ACER3和SPHK1基因表達下調,表明鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)的產生受到干擾,提示IPF肺中鞘脂代謝降低。神經酰胺/鞘氨醇和S1P構成的代謝平衡參與細胞增殖與凋亡的調控[14]。S1P還與轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信 號 有關[15-16]。鞘氨醇激酶1通過細胞內S1P抑制結締組織生長因子表達[17],而細胞外S1P通過激活Rho信號級聯,交叉激活結締組織生長因子,從而加劇纖維化過程[15]。由此可見,IPF肺組織中細胞增殖及結構重塑與鞘磷脂代謝的改變有一定關系。

1.2 精氨酸與鳥氨酸代謝 精氨酸代謝產物參與多種途徑,其中肌酸參與ATP的產生,而鳥氨酸可以轉化為腐胺和亞精胺,參與細胞增殖。鳥氨酸也可以轉化為脯氨酸和羥脯氨酸,用于纖維化的膠原形成。Kang等[18]通過氣相色譜與質譜聯用技術檢測13例IPF患者和15名健康受試者的肺組織,發現IPF患者肺組織中膠原的關鍵成分脯氨酸水平較對照組增加,這歸因于通過鳥氨酸轉氨酶途徑產生的脯氨酸增加。相似地,Zhao等[13]的研究結果表明IPF患者肺組織中精氨酸代謝物肌酸、4-羥脯氨酸、腐胺和亞精胺水平升高。有實驗顯示在人IPF肺組織和博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中精氨酸酶表達增加[19-20]。精氨酸酶將精氨酸轉化為鳥氨酸,鳥氨酸是脯氨酸、羥脯氨酸、腐胺和亞精胺的前體,因此這些代謝物的增加可以用上調的精氨酸酶與鳥氨酸轉氨酶來解釋。羥脯氨酸是細胞外基質中膠原的重要組成部分[21],其升高是纖維化的標志。大量研究表明,多胺與細胞增殖、分化密切相關[22-23]。由此可見,精氨酸代謝與鳥氨酸代謝的上調在IPF發生發展中有一定作用。

1.3 核苷代謝 Kang等[18]的代謝研究表明,IPF患者肺組織中嘌呤代謝物肌苷和次黃嘌呤與正常肺組織相比增加。肌苷是腺苷的前體,細胞外腺苷水平與肺纖維化的進展與加重密切相關[24]。Luo等[24]發現支氣管肺泡灌洗液中的腺苷水平隨著肺纖維化的進展而逐漸升高,在進展性纖維化模型中,提高腺苷水平會導致更嚴重的纖維化。且腺苷水平升高與IL-6和IL-17升高相關,而IL-6和IL-17是肺纖維化中重要的炎性細胞因子。研究表明,IPF患者肺部腺苷受體增加[25]。嘌呤能信號的調節可調控組織修復和纖維化過程中的基質沉積[26]。因此,嘌呤代謝與IPF組織的瘢痕形成有密切關系。

1.4 脂肪酸β-氧化及三羧酸循環 細胞能量學對于維持肺細胞功能非常重要。主要營養底物如糖、氨基酸和脂肪酸的分解代謝將乙酰輔酶A引入三羧酸循環,產生合成核苷酸、蛋白質和脂質所需的代謝物,并產生能量。線粒體是細胞中重要的產生能量的結構,已有研究在不同的IPF肺細胞(肺泡上皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞)中發現了線粒體功能障礙和代謝重編,這些促進了肺泡結構的低彈性改變,并增加了肺部細胞對促纖維化反應激活的敏感性[27]。Zhao等[13]發現IPF患者肺中長鏈脂肪酸己酸、辛酸、肉豆蔻酸和棕櫚油酸水平顯著升高,中鏈酰基肉堿己酰肉堿、辛酰肉堿、棕櫚酰肉堿和琥珀酰肉堿明顯減少。脂肪酸需肉堿轉運至線粒體中發生β-氧化,游離脂肪酸積累及肉堿穿梭減少表明IPF肺組織中線粒體的脂肪酸β-氧化減少。三羧酸循環接受β-氧化和糖酵解產生的乙酰輔酶A,并為電子傳輸鏈生成還原型黃素二核苷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸,是細胞能量產生的重要途徑。Zhao等[13]發現IPF肺組織中琥珀酰輔酶A合成酶及其代謝產物順式烏頭酸增加,而編碼異檸檬酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和檸檬酸合成酶的基因顯著減少,趨勢是三羧酸循環酶和代謝物減少,潛在地表明IPF中三羧酸循環下調。三羧酸循環、線粒體β-氧化的減少可能導致替代能源途徑上調,以支持細胞生長和肺結構重建。上調的肌酸代謝可能是其中之一。

1.5 糖代謝 糖酵解重編在IPF發病機制中起一定作用。Xie等[28]的實驗研究表明糖酵解增強是肌成纖維細胞分化過程中的早期和持續事件,抑制糖酵解酶PFKFB3的藥理或遺傳方法不僅減少了體外成纖維細胞的激活,而且顯著改善了小鼠肺纖維化的嚴重程度。而Zhao等[13]研究顯示IPF肺中晚期糖酵解代謝產物1,6-二磷酸果糖和磷酸烯醇式丙酮酸水平明顯低于正常,且糖酵解酶PFKFB3、PFK、PGAM1、PGAM4、G6PC3和SLC2A4RG基因表達下調,提示糖酵解率降低。但IPF組乳酸水平都高于對照組[13,28]。糖酵解高活性之后的乳酸發酵替代穩態糖酵解之后的丙酮酸氧化,是肺癌代謝的標志,被稱為Warburg效應[29-30]。這種“有氧糖酵解”的確切機制尚不清楚,有人認為細胞增殖和細胞外基質的產生與這種糖酵解的變化有關[31]。IPF患者肺組織中乳酸水平升高,也提示IPF肺組織中的TGF-β激活機制可能是一種p H依賴性機制,促使IPF中肌成纖維細胞的分化[32]。

2 通過代謝組學技術尋找生物標志物的研究進展

生物標志物可用于疾病診斷、判斷疾病分期或者用來評價藥物在目標人群中的安全性及有效性。發現疾病相關的診斷標志物是疾病診斷的關鍵。脂組學作為代謝組學的一個分支,能夠監測患者與正常者之間的脂質變化,從中找到差異較大的脂質化合物,作為疾病早期診斷的指標。Yan等[33]采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用技術檢測IPF患者血漿中的血脂變化,鑒定其生物標志物,隨后采用相關分析、受試者工作特征曲線和正交偏最小二乘判別分析評價脂代謝產物的變化,總共檢測到62種獨特的脂質,其中甘油磷脂24種,甘油脂30種,甾醇類3種,鞘脂4種,脂肪酸1種。所有測定的甘油磷脂和鞘磷脂在IPF對象中均呈下降趨勢。其中6個(編碼分別為R7、R9、R13、R16、R17和R21)對IPF組與對照組的鑒別具有較高的敏感性,可能成為未來診斷IPF疾病的潛在生物標志物,且性別和吸煙與這6個有希望的生物標志物水平沒有相關性。

實時呼吸分析以非侵入性、快速和無痛的方式洞察人體新陳代謝,為IPF的診斷提供了新思路。Gaugg等[34]用二次電噴霧電離質譜分析實時呼氣驗證Kang等[18]在IPF患者肺組織中檢測到的氨基酸信號結果,發現IPF患者呼吸中脯氨酸、4-羥脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸/異亮氨酸和大蒜氨酸水平顯著升高,而焦谷氨酸和苯丙氨酸水平無顯著性差異。大蒜素在膠原和彈性蛋白纖維的交聯中起著關鍵作用[35]。彈性蛋白含有豐富的脯氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。焦谷氨酸和苯丙氨酸在膠原蛋白和彈性蛋白中含量較低。與其他生理參數的相關分析表明,IPF患者的氨基酸呼吸水平與通常用于IPF分期的肺功能參數(預計用力肺活量百分比和肺一氧化碳擴散能力預測百分比)基本無關,可見Gaugg等[34]通過實時呼吸分析檢測到的氨基酸差異代謝物在預測IPF疾病的嚴重程度時有限,通過代謝組學技術尋找判斷IPF分期的生物標志物有待進一步研究。

Rindlisbacher等[36]通過超高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術分析IPF患者呼氣冷凝液,發現58個代謝特征可以區分IPF患者的呼氣冷凝液和健康對照者的呼氣冷凝液。其中分子式為C21H44N2O的代謝物在IPF患者中與健康對照組相比上調了2.5倍,并在第二組IPF患者和健康對照組中得到驗證。C21H44N2O可能是診斷IPF的潛在生物標志物,其結構仍需進一步研究。

Zhou等[37]通過UPLC-ESI-Q-TOFMS系統鑒定出IPF治療藥物尼達尼布在體內外的19個代謝產物(其中8種未被描述),ADMET預測表明尼達尼布是細胞色素P450 3A4(CYP3A4)的底物,并且其大部分代謝物可能具有潛在的肝毒性和心臟毒性。此研究有助于了解尼達尼布相關不良反應的機制,關于尼達尼布對IPF的治療反應標志物有待進一步探尋。

3 通過代謝組學技術對有效治療靶點的探尋

Rindlisbacher等[38]通過超高效液相色譜-高分辨質譜聯用的方法檢測到,與健康對照組相比,IPF患者血清中溶血磷脂酰膽堿和3-羥基癸酰肉堿水平升高。肺損傷后,表面活性脂質成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿被磷脂酶A2降解為溶血磷脂酰膽堿[39]。溶血磷脂酰膽堿是溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)的前體,主要由自體趨化素轉化。LPA是一種生物活性甘油磷脂,通過上皮細胞凋亡、血管滲漏、成纖維細胞遷移和增殖誘導肺、腎和肝纖維化[40-43]。先前的研究顯示IPF患者支氣管肺泡灌洗液和呼氣冷凝液中LPA水平升高[43-44]。LPA還通過LPA受體2誘導αvβ6整合素介導的支氣管上皮細胞TGF-β活化[45]。GLPG1690是一種口服型自體趨化素抑制劑,目前正在進行IPF的Ⅲ期臨床試驗,涉及750例受試者,最短治療期為52周,若結果為陽性可能最終意味著GLPG1690單獨或聯合使用將成為IPF患者急需的新治療選擇[46]。

由于膠原蛋白含有高濃度的甘氨酸和脯氨酸,幾個小組已經測試了抑制氨基酸生物合成是否在減少纖維化反應方面可能有效。為了支持這一方法,Hamanaka等[47]發現,從頭開始的絲氨酸和甘氨酸合成途徑在TGF-β誘導的膠原合成和博來霉素誘導的肺纖維化過程中是必須的,絲氨酸和甘氨酸合成途徑中的磷酸甘油酸脫氫酶可能是治療IPF的潛在靶點。磷酸甘油酸脫氫酶小分子抑制劑NCT-503可以顯著減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的嚴重程度[47]。到目前為止,還沒有確定抑制其他涉及氨基酸生物合成的酶是否同樣有效。

4 結語

IPF是一種由多種原因導致的肺部纖維化疾病,預后差,病死率高。其發病機制尚未完全闡明,且治療手段有限。代謝組學作為后基因組研究中發展最快的領域之一,可反映各種因素作用于生物體的終末效應,具有綜合信息優勢。通過代謝組學技術發現的IPF基本生化途徑的擾動有助于更全面地了解IPF發病機制；通過代謝組學技術探尋到的IPF生物標志物有助于減少IPF診斷時患者的損傷風險；通過代謝組學啟發尋找到的GLPG1690、NCT-503等藥物作用靶點最終將促進患者個性化治療的發展,提高患者生活質量。雖然代謝組學技術在代謝物的身份驗證等方面仍具有相當大的挑戰,但隨著技術的進步,高分辨率分析儀器(如QTOF-MS)提供的代謝物覆蓋范圍不斷擴大,利用代謝組學技術對IPF的研究將具有更廣闊的前景[48]。

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