lncRNA MEG3在2型糖尿病伴Hp感染患者血清中的表達及意義*

田艷娟,楊小東,劉成功

駐馬店市中心醫(yī)院全科醫(yī)療科(河南駐馬店 463000)

2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)是以胰島素抵抗所導致的高血糖為主要特征的慢性代謝性炎性疾病，其發(fā)病率呈增長趨勢，成為繼腫瘤、心血管疾病之后的第3位威脅人類健康的重大疾病[1]。研究[2]顯示，炎癥可引起胰島素抵抗和胰島β細胞凋亡，氧化應激可降低胰島β細胞功能，導致T2DM的發(fā)生。幽門螺桿菌(helicobacter pylori，Hp)是一種革蘭陰性彎曲桿菌，Hp感染可導致患者出現(xiàn)胰島素抵抗、血脂氧化代謝紊亂以及氧化應激反應[3]。由于T2DM患者自身免疫系統(tǒng)紊亂，易感染Hp[4]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，在炎癥反應和炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[5]。lncRNA MEG3是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lnc RNA。研究[6-7]顯示，lncRNA MEG3參與肺癌、胃癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可作為腫瘤治療的分子靶點和預后判斷生物標志物。但目前，lncRNA MEG3在T2DM伴Hp感染患者中的表達和意義還未知。本研究通過檢測T2DM伴Hp感染患者血清中的表達水平，初步探討其在該疾病中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年10月至2018年12月于本院就診的132例T2DM患者為研究對象，診斷符合2013年中華醫(yī)學會糖尿病學分會制定的中國糖尿病防治指南[8]，其中男59例，女73例。排除患有嚴重腎、肝及血管疾病的T2DM患者。經(jīng)13C尿素呼氣試驗(13C-UBT，DOB>4為陽性，即感染Hp)檢測Hp感染者83例(感染Hp組)，非感染者49例(非感染Hp組)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意，患者自愿簽署知情同意書。

1.2 血樣采集和指標檢測 采集所有受試者清晨空腹靜脈血，3 500 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。島津8000全自動分析儀檢測血清游離脂肪酸(FFA)水平，乳膠增強免疫(超敏)比濁法檢測超敏C反應蛋白(hs-CRP)，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)、硫代巴比妥酸法檢測血清丙二醛(MDA)水平，黃嘌呤氧化酶法檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)，還原型谷胱甘肽消耗法檢測血清谷胱甘肽還原酶(GSH-Px)，試劑盒(科研用)均購自南京建成生物工程研究所，所有樣本檢測時，均設置3個復孔，結(jié)果取平均值。

1.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測血清lncRNA MEG3表達水平 Trizol試劑提取血清中總RNA，使用微量核酸儀檢測RNA在260 nm和280 nm處的吸光度值(A)，比值(A260nm/A280nm)處于1.8～2.0范圍內(nèi)說明RNA純度較好，可用于后續(xù)檢測。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA合成為cDNA。以cDNA為模板，進行擴增，總體系20 μL。擴增條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)。lncRNA MEG3上游5′-GCCTGCTGCCCATCTACAC-3′，下游5′-CCTCTTCATCCTTTGCC ATC-3′；GAPDH上游5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′，下游5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(lyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算lncRNA MEG3的相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 T2DM伴Hp感染患者血清中l(wèi)ncRNA MEG3和FFA水平 與非感染Hp組比較，感染Hp組患者血清lncRNA MEG3水平顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)FA水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者血清lncRNA MEG3和FFA水平

2.2 T2DM伴Hp感染患者血清炎性因子表達水平 與非感染Hp組比較，感染Hp組患者血清TNF-α、IL-6和hs-CRP水平均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者血清炎性因子表達水平

2.3 T2DM伴Hp感染患者血清氧化應激指標水平 與非感染Hp組比較，感染Hp組患者血清MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者血清氧化應激指標水平

2.4 T2DM伴Hp感染患者血清中l(wèi)ncRNA MEG3與FFA、炎性因子、氧化應激指標的相關性 Pearson相關性分析結(jié)果顯示，T2DM伴Hp感染患者血清lncRNA MEG3水平與FFA、TNF-α、IL-6、hs-CRP和MDA呈負相關(P<0.05)，與SOD和 GSH-Px呈正相關(P<0.05)。見表4。

表4 血清lncRNA MEG3水平與FFA、炎性因子、氧化應激指標的相關性

2.5 影響T2DM患者感染Hp的Logistic多因素分析 Logistic多因素分析結(jié)果顯示，lncRNA MEG3是影響T2DM患者感染Hp的獨立因素(P<0.05)。見表5。

表5 Logistic多因素分析

3 討論

MEG3基因位于染色質(zhì)14q32.3，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為lncRNA。近年來研究表明，lncRNA MEG3在與心血管疾病和炎癥性疾病密切相關[9-10]。Zhou等[11]研究顯示，lncRNA MEG3在冠狀動脈疾病患者組織中表達降低，過表達lncRNA MEG3可通過靶向抑制miR-21表達降低血管內(nèi)皮細胞的增殖。劉振峰等[12]研究顯示，lncRNA MEG3在骨性關節(jié)炎軟骨組織中表達降低，其可能通過調(diào)節(jié)血管生成在骨性關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。但目前，lncRNA MEG3在T2DM伴Hp感染患者中的表達和意義還鮮見相關報道。本研究選取共選取132例T2DM患者為研究對象，其中83例患者感染Hp，感染率為62.88%，與田利華等[13]報道的T2DM患者感染率60.34%的結(jié)果接近，說明多數(shù)T2DM患者易感染Hp。與未感染Hp患者比較，T2DM伴Hp感染患者血清中l(wèi)ncRNA MEG3表達降低，是T2DM患者感染Hp的獨立影響因素，提示lncRNA MEG3可能參與T2DM感染Hp。

Hp是人類感染率最高的細菌之一，其可結(jié)合內(nèi)皮細胞，刺激細胞表達黏附因子，且分泌細胞因子，導致白細胞黏附、聚集并損傷血管內(nèi)皮，加劇局部炎癥反應[14]。Hp還可引起全身性炎癥反應升高，誘導局部動脈炎癥，促進T2DM患者動脈粥樣斑塊的形成[15]。此外，Hp可產(chǎn)生脂多糖，誘導機體免疫反應，產(chǎn)生炎性細胞因子TNF-α、IL-6和hs-CRP。TNF-α具有多種生物學效應，與其他細胞因子形成復雜免疫網(wǎng)絡，參與炎癥反應[16]。IL-6在適量濃度對機體有利，而濃度過高時會產(chǎn)生一系列炎性損害。hs-CRP是感染的敏感性指標之一，可損傷內(nèi)皮細胞功能，促進動脈粥樣硬化進展[17]。本研究顯示，T2DM伴Hp感染患者血清中hs-CRP、TNF-α和IL-6水平均顯著高于未感染Hp的T2DM患者，與相關研究報道[18]結(jié)果一致，且hs-CRP是影響T2DM感染Hp的獨立因素，說明Hp加劇了T2DM患者機體內(nèi)炎性反應。Pearson相關性分析顯示，T2DM伴Hp感染患者血清中l(wèi)ncRNA MEG3表達水平與hs-CRP、TNF-α和IL-6均呈負相關，提示lncRNA MEG3可能通過影響機體內(nèi)炎癥因子的表達參與T2DM感染Hp。

FFA又被稱為非脂化脂肪酸，在正常機體血清中含量很少。研究[19]顯示，F(xiàn)FA可通過抑制葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運、促進胰島細胞凋亡等引起胰島素抵抗，在胰島素抵抗疾病發(fā)病過程中起重要作用。此外，F(xiàn)FA具有較強的細胞毒性，能夠損傷細胞膜、線粒體以及溶酶體等，引起機體內(nèi)活性氧簇的增加，加劇機體氧化應激反應[20]。本研究顯示，F(xiàn)FA在T2DM伴Hp感染患者血清中水平明顯高于未感染Hp的T2DM患者，其lncRNA MEG3表達與FFA水平呈負相關，提示lncRNA MEG3可能在FFA加劇T2DM患者氧化應激中起調(diào)控作用。

氧化應激可損傷胰島β細胞，引起胰島素抵抗，促進T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[21]。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其水平高低可間接反映機體的氧化應激狀態(tài)[22]。SOD是機體內(nèi)的重要抗氧化酶，可清除氧自由基，降低對機體組織細胞的損傷，其活性高低反映機體的抗氧化能力[23]。GSH-Px也是一種抗氧化酶，與SOD具有協(xié)同作用。本研究顯示，T2DM伴Hp感染患者血清中MDA含量升高，SOD和GSH-Px活力降低，與相關研究報道[24]結(jié)果一致，說明Hp感染可增強T2DM患者的氧化應激反應，提示對于T2DM伴Hp感染患者，應采取干預措施抑制Hp感染和氧化應激。本研究還顯示，T2DM伴Hp感染患者血清lncRNA MEG3水平與MDA呈正相關，與SOD和GSH-Px呈負相關，提示lncRNA MEG3表達與T2DM伴Hp感染患者氧化應激密切相關，靶向促進lncRNA MEG3表達可能降低患者氧化應激水平。

綜上所述，lncRNA MEG3在T2DM伴Hp感染患者血清中表達降低，其可能通過調(diào)節(jié)機體內(nèi)脂肪酸水平、炎性因子表達及氧化應激水平參與T2DM感染Hp過程