miR-9-5p和miR-125b-5p在膝關節骨性關節炎軟骨中的表達及意義

王漢,龐士龍,趙曉宇

天津市寧河區醫院骨科(天津 301500)

膝關節骨性關節炎(knee osteoarthritis，KOA)作為一種常見、漸進性的膝骨關節退行性慢性病，臨床表現主要為慢性疼痛和關節活動障礙，嚴重影響患者生活質量[1]。KOA在50歲以上人群發病率高，全世界范圍內發病率高達3.8%[2]，且女性發病率偏高[3]。KOA發病機制尚不明確，環境、遺傳、機械等多種因素可共同參與膝蓋軟骨病變的生物過程。人體組織的代謝、功能與組織細胞的增殖、遷移、凋亡等生物學行為均與miRNA有著密不可分的關系，在腫瘤、骨關節炎等多種疾病中起著重要作用，因此分析KOA 中miRNAs的表達情況，對闡述miRNA在KOA軟骨退變過程中作用、探索軟骨退變的發生、發展、調控機制具有重要意義。miRNA被報道作為一種調控基因，影響骨關節炎的病理發展過程[4]，在骨關節炎的早期診斷及治療上有重要意義。研究發現，miR-9-5p可以破壞骨細胞的增殖和分化，改變細胞黏附，與軟骨損傷有關[5]。Ge等[6]研究發現miR-125b-5p可以通過調控 SYVN1 誘導滑膜細胞凋亡，然而miR-9-5p、miR-125b-5p是否與KOA發生、發展有關尚不清楚，因此本研究通過檢測miR-9-5p、miR-125b-5p在 KOA 患者軟骨和健康軟骨中的表達水平，探討其與KOA之間的關系及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2019年1月在本院骨科就診KOA患者124例為KOA組，其中男50例，女74例，年齡 57～78歲，平均(69.15±4.26)歲。

納入標準：(1)符合《骨關節炎診治指南(2007年版)》[7]；(2)疼痛VAS評分≥4分；(3)3個月內未接受其他KOA相關治療。

排除標準：(1)長期服用相關藥物者；(2)因其他疾病累及膝關節者；(3)合并有肝腎功能異常的嚴重感染性疾病者；(4)風濕系列陽性以及妊娠和哺乳期婦女。

根據改良的ManKin[8]關節軟骨評分標準，將KOA組軟骨標本(重度退變軟骨、中度退變軟骨、輕度退變軟骨)分為重度組(32例)、中度組(44例)和輕度組(48例)；選取同期因交叉韌帶斷裂、盤狀軟骨損傷等在本院建卡就診的膝關節軟骨無病變的患者124例為對照組(NC組)，其中男52例，女72例，年齡56～77歲，平均(67.95±4.79)歲。納入標準：(1)病理學診斷膝關節無病變；排除標準同KOA組排除標準。兩組間性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經本院道德倫理委員會批準通過，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(貨號：DP443)，購自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix(貨號：Q221-01)，購自南京vazyme生物公司；引物由上海生工生物公司設計合成；qRT-PCR儀(型號：CFX96)，購自美國Bio-Rad公司；白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1) ELISA試劑盒(貨號：A099472-48T)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6) ELISA(貨號：K215741)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA(貨號：K219238)、白細胞介素-8 (interleukin-8，IL-8)ELISA試劑盒(貨號：A100081-48T)、軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligom eric matrix protein，COMP) ELISA試劑盒(貨號：A097701-48T)購自上海扶生實業有限公司，基質金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13) ELISA試劑盒購自美國Abcam公司，ELX800型全自動酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 組織來源及樣品制備 (1)組織來源：分別收集在本院因KOA行關節置換術或關節鏡清理手術患者的軟骨組織和因交叉韌帶斷裂、盤狀軟骨損傷等行手術治療患者自愿捐贈的健康軟骨標本。(2)軟骨組織RNA樣品制備：在凍存軟骨組織中加入Trizol 液勻漿，PBS 緩沖液洗滌；加入1 mL Trizol 裂解液，離心后取上層水相，加入等體積異丙醇，離心，棄上清，沉淀干燥后用 DEPC 水溶解得到RNA原液。Nano-Drop 2000測量記錄RNA濃度。其余樣品-80℃保存備用。

1.3.2 熒光定量PCR檢測miR-9-5p、miR-125b-5p表達水平 采用RNA提取試劑盒提取血清總RNA，反轉錄得cDNA。采用定量PCR儀對miR-9-5p、miR-125b-5p進行擴增。qRT-PCR反應體系共10 μL：miScript SYBR?Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應條件：95℃，90 s；95℃，30 s；63℃，30 s；72℃，15 s；40個循環。miR-9-5p、miR-125b-5p及內參U6的引物序列見表1。采用2-ΔΔCT法對血清miR-9-5p、miR-125b-5p表達水平進行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 酶聯免疫法測定軟骨組織中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP水平 采用酶聯免疫法測定軟骨中各炎癥因子的的表達水平，檢測操作嚴格按照試劑盒說明書進行。為控制檢測質量，本次研究所有樣品的檢測均由檢驗科同一批人員在同臺儀器上操作，每個樣本均設3次重復。

1.4 統計學方法 利用SPSS 23.0統計軟件進行統計學分析，計數資料采用例(%)表示，行2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，行t檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析。各組數據均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KOA組、NC組軟骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表達水平比較 相對于NC組，KOA組患者軟骨中miR-9-5p表達水平顯著下調(P<0.05)，miR-125b-5p表達水平顯著上調(P<0.05)，見表2。

表2 KOA組、NC組軟骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表達水平比較

2.2 KOA患者重度、中度、輕度組軟骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表達水平比較 相對于輕度組，重度組、中度組miR-9-5p表達水平顯著降低(P<0.05);相對于中度組，重度組miR-9-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。相對于輕度組，重度組、中度組miR-125b-5p表達水平顯著上升(P<0.05)；相對于中度組，重度組miR-125b-5p表達水平顯著上升(P<0.05)，見表3。

表3 KOA患者重度、中度、輕度組軟骨中miR-9-5p、miR-125b-5p表達水平比較

2.3 KOA組、NC組各炎癥因子表達水平比較 輕度組、中度組、重度組KOA患者軟骨中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP含量依次升高(P<0.05)，見表4。

表4 KOA組、NC組各炎癥因子表達水平比較

2.4 KOA患者軟骨組織miR-9-5p、miR-125b-5p表達水平與各炎癥因子表達水平相關性分析 KOA患者軟骨組織miR-9-5p水平與IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP、miR-125b-5p水平呈負相關(P<0.05)；miR-125b-5p水平與IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP水平呈正相關(P<0.05)，見表5。

表5 KOA患者軟骨組織miR-9-5p、miR-125b-5p表達與各炎癥因子表達水平相關性

3 討論

關節軟骨由軟骨基質和軟骨細胞構成，在KOA病程中最早出現病理變化。軟骨細胞是成熟軟骨中與修復破壞軟骨有關的細胞類型。有研究發現KOA患者膝關節軟骨細胞明顯減少[9]，可能與膝關節中發生的炎癥反應有關。針對其發病機制對KOA進行預防及早期診斷、治療非常重要。全身軟骨代謝異常、年齡、體重、遺傳、創傷、局部炎癥反應以及自身免疫和局部應力等都是 KOA 發生的相關因素。研究表明[10]，miRNA在KOA發生、發展中有重要作用，miRNA的表達可調控軟骨細胞的反應活性和修飾代謝過程，與KOA發生、發展相關。

研究[5]認為，miR-9-5p可通過上調nemo樣激酶誘導骨骼細胞凋亡，具有損害骨細胞增殖分化、改變細胞黏附和凋亡的作用。Sun等[11]在研究中得出類似結論，miR-9-5p抑制骨細胞增殖、細胞分化和細胞黏附。Chen等[12]發現miR-9-5p在骨關節炎小鼠模型中表達下調，可通過調控骨關節炎小鼠的固生蛋白C，促進軟骨重塑，抑制軟骨細胞凋亡，過表達miR-9-5p可改善小鼠的軟骨重塑。Li等[13]研究證明，過表達miR-9-5p可促進軟骨細胞中間充質干細胞和高遷移能力的間充質干細胞的遷移能力。本研究發現KOA患者軟骨細胞中miR-9-5p相對于正常軟骨細胞，表達顯著下調，提示miR-9-5p可能與KOA的發生有關。進一步研究發現，miR-9-5p的表達水平在輕度組、中度組、重度組KOA患者軟骨細胞中依次下降，說明miR-9-5p在KOA患者軟骨中的表達水平與患者病情有關，一定程度上可能反映患者病情嚴重程度。

徐永明等[14]研究發現miR-125a-5p與大鼠的終板軟骨退變有密切聯系。Ge等[6]研究發現miR-125b-5p在關節炎患者滑膜細胞中表達量顯著升高，提示miR-125b-5p的表達與關節炎的發生有關。與Ge等研究結果相似，本研究發現，miR-125b-5p在KOA患者軟骨細胞中高表達，說明miR-125b-5p可能與KOA的發生有關，并且miR-125b-5p在輕度組、中度組、重度組KOA患者軟骨細胞中表達水平依次升高，說明miR-125b-5p的表達水平與KOA患者的病情有關。

參與KOA病情發展的細胞因子有很多，Rasheed等[15]研究發現miRNA-125b-5p可通過調控MMP-13、IL-6等在內的炎癥因子表達，參與KOA過程中炎癥反應進展。IL-1可通過刺激滑膜細胞產生膠原酶和酪蛋白酶[16]，刺激軟骨細胞產生MMP，起到快速促炎癥作用[17]。孫文才等[18]對KOA患者血清及關節液中細胞因子表達水平研究發現，KOA患者血清和關節液中細胞因子TNF-α、IL-1、IL-6水平異常增高。研究顯示[19]，IL-8可通過抑制軟骨基質的多種功能活動加速膝關節炎癥病變。鄧超等[20]研究發現，接受電針治療后患者疼痛評分、情緒評分顯著降低，血清中IL-8含量顯著降低，提示血清IL-8含量的降低可能與KOA病情減輕有關。TNF-α盡管在骨關節炎關節組織中檢測水平很低，也是KOA中基質退變的一個重要介質，是滑膜炎癥的關鍵細胞因子。李洪濤等[21]用研究發現MMP-13表達下調可以抑制炎性因子的釋放、阻止軟骨基質的降解，進而保護受損的關節軟骨,促進關節軟骨的結構和功能的恢復，說明MMP-13表達下調與KOA患者病情恢復有關。COMP是透明軟骨的重要組成成分，主要由軟骨細胞和滑膜細胞分泌，姚麗等[22]研究表明，大鼠膝骨關節炎模型膝關節滑膜組織中COMP含量顯著高于對照組，提示COMP表達的升高參與誘導軟骨降解，該變化與骨關節滑膜組織炎癥有關。本研究發現IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MMP-13、COMP在KOA患者軟骨組織中表達均顯著上升，且在輕度組、中度組、重度組中含量依次增加，提示KOA患者均存在一定程度炎癥反應，且隨病情惡化，炎癥程度增加。Pearson相關分析發現KOA患者軟骨組織中miR-9-5p水平與miR-125b-5p、IL-1等炎癥指標水平呈負相關，miR-125b-5p與IL-1等炎癥指標水平呈正相關，說明miR-9-5p、miR-125b-5p可能通過影響KOA患者炎癥反應情況，影響KOA患者病情進展。

綜上所述，miR-9-5p在KOA患者軟骨中低表達，miR-125b-5p在KOA患者軟骨中高表達，兩者可能與KOA疾病發生、發展有關。本研究的不足之處在于樣本量少，研究范圍局限，因此miR-9-5p、miR-125b-5p在KOA患者軟骨中的表達和意義的相關研究還需加大樣本量擴大規模進一步深入研究。