雙葛止瀉口服液微生物限度檢查方法學驗證

桑卡娜，李煥娟，楊絨娟，周德剛

(洛陽惠中獸藥有限公司，國家獸用藥品工程技術研究中心，河南洛陽 471003)

雙葛止瀉口服液是由洛陽惠中獸藥有限公司、普萊柯生物工程股份有限公司和河南新正好生物工程有限公司聯合研制的三類新獸藥。雙葛止瀉口服液由金銀花、葛根、黃芩、黃連、白芍和炙甘草組成，來源于《傷寒論》中的“葛根芩連湯”。方中金銀花具有解熱、抗炎、抗病毒等藥理作用[1-2]，葛根芩連湯對感染性腹瀉具有一定的治療作用[3-4]。由于中藥復方成分復雜，中藥制劑中的不同成分對微生物有一定的抑制和殺滅作用，常規法進行微生物限度檢測，不能真實反應樣品中的微生物情況，需采用適當的方法，例如薄膜過濾法、中和劑、培養基稀釋法等，去除其抑菌作用，并對方法進行驗證來確定所采用的微生物限度檢查方法的可行性和有效性[5-7]。依據2015年版 《中華人民共和國獸藥典(二部)》通則1102非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法，以及通則1103非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法和通則1104非無菌獸藥微生物限度標準進行方法適用性試驗，建立適合雙葛止瀉口服液的微生物限度檢查方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器 集菌儀，型號HTY-602，浙江泰林生物技術股份有限公司；電子天平，型號JA2003，上海上平儀器有限公司；電熱恒溫培養箱，型號DNP-9272BS-Ⅲ，上海新苗醫療器械制造有限公司；生化培養箱，型號SPX-150BSH-Ⅱ，上海新苗醫療器械制造有限公司；生物安全柜，型號Nu-425-400S，美國Nuaire公司；全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，型號YXQ-LS-100A，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；微量移液器，規格100 μL、1000 μL、5 mL，德國Eppendorf公司；電動移液槍，型號E4XLS，規格20～200 μL，美國Rainin公司。

1.1.2 供試品 雙葛止瀉口服液；批號：20170201；規格：每1 mL相當于原生藥0.45 g；包裝：口服液體藥用聚丙烯瓶；生產廠家：洛陽惠中獸藥有限公司。

1.1.3 菌株、試劑及材料 金黃色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕、銅綠假單胞菌〔CMCC(B)10104〕、枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕、大腸埃希菌〔CMCC(B)44102〕、白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕、黑曲霉菌〔CMCC(F)98003〕，購自中國食品藥品檢定研究院醫學菌種保藏中心。

胰酪大豆蛋白胨液體培養基，批號20170116；胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養基，批號20161018；沙氏葡萄糖瓊脂培養基，批號20160924；沙氏葡萄糖液體培養基，批號20160224；麥康凱瓊脂培養基，批號20170113；麥康凱液體培養基，批號20161222；麥康凱瓊脂培養基，批號20161021；pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號20160321；Kovacs氏靛基質，批號20161117；甲基紅試劑盒，批號20161208；V-P試劑盒批號，20170214，均購自青島高科園海博生物技術有限公司。量筒、EP管、一次性無菌平皿、涂布棒、試管架、酒精燈、鑷子。無菌薄膜過濾器，型號FC752，浙江泰林生物技術股份有限公司。

1.2 試驗方法 依照2015版《中華人民共和國獸藥典(二部)》通則1102、1103、1104[8]有關非無菌產品微生物限度檢查方法進行驗證。

1.2.1 菌液制備 取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌第二代甘油保存物100 μL加到10 mL胰酪大豆蛋白液體培養基中，置35 ℃培養24 h。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌培養物1 mL加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5、10-6、10-7，取稀釋液各0.1 mL加入制備好的胰酪大豆蛋白胨瓊脂平皿，涂布棒涂勻后置35 ℃培養24 h，每個稀釋度3個重復，計菌落數。

取白色念珠菌的第二代甘油保存物100 μL加到10 mL沙氏葡萄糖液體培養基中，置25 ℃培養48 h。取培養物1 mL，加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-4、10-5、10-6，取稀釋液各0.1 mL加入制備好的沙氏葡萄糖瓊脂平皿，涂布棒涂勻后置25 ℃培養2 d，每個稀釋度3個重復，計菌落數。

取黑曲霉凍干粉，溶于0.9%氯化鈉溶液中，混勻，用接種環蘸取，劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上，置25 ℃培養5 d。取沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養物，加0.9%氯化鈉溶液5 mL，洗下孢子，轉移至另一空管，取1 mL加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-4、10-5、10-6，取稀釋液各0.1 mL加入制備好的沙氏葡萄糖瓊脂平皿，涂布棒涂勻后置25 ℃培養5 d，每個稀釋度3個重復，計菌落數。

在大興安嶺，最早的春色出現在向陽坡。嫩綠的草芽像繡花針一樣頂破豐厚的腐殖土，要以它的妙手，給大地繡出生機時，背陰山坡往往還有殘雪呢。這樣的殘雪，還妄想著做冬的巢穴。然而隨著冰河乍裂，達子香花開了，是透著清香的樹、爛漫的山花和飛起飛落的鳥兒。那蜿蜒在林間的一道道春水，被暖風吹拂得起了魚苗似的波痕。投在水面的陽光，便也跟著起了波痕，好像陽光在水面打起蝴蝶結了。

1.2.2 計數方法適用性試驗

為了評價實驗結果的精度,計算了重復性實驗的相對標準偏差和平均相對誤差。在全量程范圍內和同一工作條件下,傳感器系統的重復性誤差指標以相對標準偏差RSD表示,其計算公式如下[19]:

判定依據：試驗組檢出大腸埃希菌，陰性對照組無菌生長，則試驗成立。反之，則判斷試驗無效。試驗組若未檢出試驗菌，應消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法適用性試驗。

試驗成立時，供試品組麥康凱瓊脂培養基平板上無菌生長，或者雖有菌生長但鑒定結果為陰性，判定未檢出大腸埃希菌。

供試品對照組：用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤濕濾膜后(水膜)，取供試液10 mL加入100 mL pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻，加入薄膜過濾器的濾筒中過濾，用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL。

王劍波先生：汽車行業供應鏈非常復雜。主機廠在歐洲、北美洲和亞洲都有。一級供應商在全球范圍內也都有。但是說到汽車電子這一部分，生產商主要集中在亞洲，而在亞洲范圍內看，又主要集中在中國。不過反過來看，中國自主品牌主機廠的供應鏈也不一定都在中國。因此，這是水乳交融的狀態。由于合同與法律問題的限制，我不能透露全部具體客戶的名字，但是可以透露的是，在汽車領域，保時捷、吉利領克和廣汽是我們的合作伙伴，此外，還有哈雷摩托也是我們的客戶。

菌液對照組：用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤濕濾膜后(水膜)，用100 mL pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液過濾，再用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩緩沖液沖洗3次，每次100 mL，最后一次沖洗時，沖洗液中加入不大于100 CFU/mL的試驗菌1 mL，搖勻后，濾過濾膜。

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陰性對照組：用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤濕濾膜后(水膜)，用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL。

結果分析：選用計數方法適用性試驗中較常見的金黃色葡萄球菌作為添加菌株，由計數方法適用性試驗結果可知，菌液回收比值為0.421，未在藥典規定的0.5～2之間，菌液回收率較低，表明本試驗供試品雙葛止瀉口服液具有一定的抑菌作用，需要采用一定的方法消除其抑菌作用，保證菌液回收率在0.5～2范圍內再進行微生物計數檢測。

1.2.2.1 常規法(培養基平皿傾注) 試驗組：無菌取供試液1 mL和稀釋至不大于100 CFU/mL的金黃色葡萄球菌1 mL注入無菌培養皿后，傾注20 mL 胰酪大豆胨瓊脂培養基于平皿中，混勻，制備2份平行樣本的平皿放入培養箱中，35 ℃培養48 h，計數后取平均值。供試品對照組：參照試驗組的方法，不加菌液，測供試品的菌數。菌液對照組：參照試驗組的方法，不加供試品，測供菌液的菌數。結果判定：菌液回收比值=(試驗組菌數-供試品對照組菌數)/菌液對照組菌數。

1.2.3 控制菌檢查(常規法) 無菌操作取2瓶雙葛止瀉口服液混合均勻后，取出10 mL至無菌玻璃瓶中，加入pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為1∶10的供試液。

取100 mL胰酪大豆胨液體培養基3瓶，試驗組加入10 mL供試液及不大于100 CFU/mL的大腸埃希菌1 mL；菌液對照組加入10 mL pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液及不大于100 CFU/mL的大腸埃希菌1 mL；供試品對照組加入10 mL供試液。同時設陰性對照組。混勻后置于35 ℃培養24 h。

結果分析：由常規法可知，雙葛止瀉口服液具有一定的抑菌作用，需要采用一定的方法消除供試品的抑菌活性。由于本產品為中藥口服溶液，水溶性好，可順利通過濾膜，故采用較常用且去除抑菌作用效果好的薄膜過濾法進行方法驗證。

表1 大腸埃希菌與非大腸埃希菌的生化鑒別

1：如出現表1以外的生化反應類型，表明培養物可能不純，應重新劃線分離，必要時做重復試驗。2：IMViC 生化試驗為“++--”或“-+--”判定為大腸埃希菌。

1.2.2.2 薄膜過濾法 制備供試液：無菌操作取2瓶雙葛止瀉口服液混合均勻后，取出10 mL至無菌玻璃瓶中，加入pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，混勻，作為1∶10的供試液。分別按以下方法對5種試驗菌株進行計數方法適用性試驗。試驗組：用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，潤濕濾膜后(水膜)，取供試液10 mL加入100 mL pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻，加入薄膜過濾器的濾筒中過濾，用pH值7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL，最后一次沖洗時，沖洗液中加入不大于100 CFU/mL的試驗菌1 mL，搖勻后，濾過濾膜。

5) 換向。當車鐘手柄從非海上全速正車位置直接扳到倒車任意位置時，主機轉速下降到制動轉速，輸出停車指令控制主機停機，待主機停機之后反向啟動主機。

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2 結果與分析

2.1 菌液計數 各菌株菌落計數結果如表2所示，根據計數結果用0.9%氯化鈉溶液將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌10倍稀釋至10-7，白色念珠菌10倍稀釋至10-6，黑曲霉菌10倍稀釋至10-5，約為不大于100 CFU/mL的菌懸液備用。

表2 細菌計數結果(CFU/mL)

2.2 計數方法適用性試驗結果

2.2.1 常規法(培養基平皿傾注) 采用常規平皿法培養基傾注進行樣品中需氧菌總數的方法驗證，具體結果見表3所示。

表3 常規法進行方法適用性檢查

過濾完成后將濾膜取出，將濾膜的菌面朝上貼于瓊脂平板上。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌制備的濾膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基，35 ℃培養3 d，計數。白色念珠菌和黑曲霉平行制備2份濾膜，一份貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基，35 ℃培養5 d，計數；另一份貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，25 ℃培養5 d，計數。

2.2.2 薄膜過濾法 采用薄膜過濾法，每個樣品沖洗3次，100 mL/次，并重復進行3次獨立平行薄膜過濾法試驗驗證，計數驗證結果見表4和表5。

從我國刑法的發展過程來看，自從新中國第一部刑法典誕生以來，我國刑事立法在總體上就呈現出擴張刑法懲罰范圍的態勢，并且，在很長的一段歷史時期內，可以預見，我國刑法的發展方向依然是犯罪化。近年來刑法修正案對金融犯罪、有組織犯罪、環境犯罪、食品安全犯罪、貪污賄賂犯罪以及侵犯公民人身和財產權利的諸多罪名的入罪標準和構成形態的修改足以說明，我國刑事立法呈現出大規模的犯罪化的趨勢，以積極而充分發揮刑罰對社會基本安全和秩序的塑造和保護作用。

表4 需氧菌總數計數方法驗證結果(CFU/皿)

表5 霉菌和酵母菌總數計數方法驗證結果(CFU/皿)

取上述培養物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養基中，42 ℃培養24 h。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基上，35 ℃培養24 h。麥康凱瓊脂培養基上若有菌落生長，挑取符合大腸埃希菌菌落特征(鮮桃紅色，圓形，邊緣整齊、表面光滑)的菌落在麥康凱瓊脂培養基上劃線培養，挑取符合大腸埃希菌菌落特征的菌落進行靛基質試驗、MR-VP試驗和檸檬酸鹽利用實驗。大腸埃希菌與非大腸埃希菌的生化鑒別見表1(GB 4789.38-2012)。

結果可知，各試驗菌試驗組菌落數減去供試液對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值均在0.5～2范圍內，符合《中華人民共和國獸藥典》 適用性試驗要求規定。且陰性對照均無菌生長，本方法可用于雙葛止瀉口服液需氧菌和霉菌及酵母菌的總數測定。

2.3 控制菌檢查結果 依據《中華人民共和國獸藥典》2015版二部1103非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法和1104非無菌產品微生物限度標準，本產品雙葛止瀉口服液，應檢測的控制菌為大腸埃希菌。采用常規法進行控制菌方法驗證，結果如表6所示。

表6 控制菌方法驗證結果

結果分析：試驗組與菌液對照組麥康凱平板上有菌落生長，IMViC生化試驗鑒定結果均為“++--”，供試品對照組和陰性對照組無菌生長。證實了常規法可用于雙葛止瀉口服液大腸埃希菌控制菌檢查，此方法成立。

3 討論與結論

3.1 方法驗證的必要性 中藥制劑成分復雜，其中任何成分具有抑菌性均可影響微生物限度檢查的準確性。2015版《中華人民共和國獸藥典》規定，中藥制劑進行微生物限度檢查時，對可能具有抑菌作用的產品，必須首先采用合適的方法消除其抑菌作用，再進行對應供試品的檢查。因此，微生物檢測方法必須經過方法的適用性試驗驗證[9-10]，才可確保微生物檢查方法的可靠性和檢查結果的準確性。

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3.2 微生物計數法 雙葛止瀉口服液由金銀花、葛根、黃芩、黃連、白芍和炙甘草組成，其組分中金銀花、黃芩對金黃色葡萄球菌等菌株均有一定的抑制作用[11]，由本試驗結果可知，常規法進行需氧菌總數的測定時，菌液回收比值較低(0.421)，未能達到試驗要求(菌液回收比值0.5～2)。故采取薄膜過濾法消除其抑菌作用后，再次進行微生物計數方法學考察，薄膜過濾法采用一次性無菌過濾器，將外界影響和操作者的主觀因素減少到最低，是檢驗各種成分劑型的首選方法[12]。雙葛止瀉口服液采用薄膜過濾法可消除其抑菌作用，各菌回收率均在規定范圍內。

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3.3 控制菌檢查法 依照《中華人民共和國獸藥典》2015版規定[8]，雙葛止瀉口服液應對大腸埃希菌進行控制菌檢查，本研究采用常規法進行控制菌檢查，方法成立。供試品雙葛止瀉口服液在微生物計數法驗證時，常規法菌落回收比值(0.4)，低于0.5，表明本產品具有一定的抑菌作用，但抑菌作用較輕微。在進行控制菌檢查時，常規法方法驗證合格。分析原因為控制菌檢查時所用培養基體積較多，有培養基稀釋去除抑菌作用的原因。故本供試品檢查時，微生物計數法需采用薄膜過濾法，控制菌檢查法可采用常規法。

我們就沿著河堤，匆匆往上游趕。五月的太陽毒得很，差不多是申時了，太陽還掛得老高。河面不時吹來陣陣熱風，熏得人閉氣。大約走了二十來里，天剛擦黑，大梁說今朝就走到這兒吧，你有身孕，往后可得悠著點兒。

供試品雙葛止瀉口服液的細菌、霉菌和酵母菌計數方法采用薄膜過濾法，控制菌檢查方法可采用常規方法進行。