伏立諾他對嚴重燙傷大鼠心臟的保護作用

孟祥熙，溫海玲，鄭金光，胡 森

突發事故和災害時，短時間內出現大量創傷、燒傷休克傷員，由于環境特殊、交通破壞、護送延遲、液體供不應求等原因使常規靜脈液體復蘇難以實施，傷員得不到及時救治，死亡率及并發癥發生率明顯增高。如果能給予抗休克維持藥物，提高機體對創傷、休克的耐受能力，保護重要臟器的功能，就能為后續治療爭取時間，提高生存率，減少并發癥。在嚴重燒傷后，體液大量丟失，有效循環血量銳減，心臟供血減少，早期就會出現心肌損傷，心肌細胞水腫、間質充血、心肌壞死，心肌損傷的早期防治對減輕心肌缺血缺氧損害，減少并發癥、提高生存率有重要意義[1，2]。伏立諾他(SAHA)是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，以往研究證實，SAHA能提高失血性休克或燙傷大鼠生存率，保護主要臟器功能[3-7]，但具體機制仍不明確。為此，本實驗通過觀察伏立諾他對50%TBSAⅢ度燙傷大鼠心肌酶指標、心肌含水率、心肌細胞凋亡率、caspase-3活性的影響及心肌組織病理學變化，為SAHA在嚴重燒傷早期保護心臟功能方面提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，60～70日齡，體重240～260 g，購自北京軍事醫學科學院動物實驗中心，購進后，適應性飼養一周以上，室溫維持在22～25 ℃，自由飲食。實驗前12 h禁食、自由飲水。

1.2 藥品和試劑 辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、戊巴比妥鈉購自SIGMA公司，Caspase-3 Assay Kit購自Abcam公司，TUNEL檢測陽性對照制備試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.3 儀器 自動生化分析儀(7170型)，日本Hitachi公司產品；高速冷凍離心機(5900)，日本Kubota公司；KD-BM生物組織包埋機，浙江科迪儀器設備公司產品；光學顯微鏡，奧林巴斯有限公司；多波長酶標儀，Dynex公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備及分組 48只雄性SD大鼠，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，剪除背部和腹部的毛發，將大鼠放置在預制模板的矩形開口，露出裸露皮膚，同時保護剩余皮膚。隨機分為3組：(1)假燙組，采用37 ℃水浴，背部15 s，腹部8 s，浸泡后腹腔內注射0.25 ml生理鹽水；(2)燙傷組，于100 ℃水浴中背部浸泡15 s、腹部浸泡8 s燙傷后，腹腔內注射0.25 ml生理鹽水；(3)SAHA組，燙傷后腹腔給予SAHA治療(7.5 mg/kg，溶于0.25 ml生理鹽水)。每組根據燙傷3、6 h兩個觀察時間點，又分為兩個亞組(n=8)。

1.4.2 指標檢測 燙傷后3、6 h抽取腹主動脈血，胸正中線剖開取心肌組織。(1)抽取腹主動脈血標本，離心后取血漿，全自動生化分析儀測定血漿磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平。(2)心肌組織含水率，采用干/濕重法檢測大鼠心肌組織含水率。取適量心肌組織，用濾紙將組織表面液體吸干，電子天平準確稱重(濕重)，將樣本放入電烤箱中80 ℃烘烤72 h，電子天平稱重烘干后的樣本并記錄數值(干重)。含水率(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。(3)心肌細胞凋亡率，TUNEL方法檢測凋亡心肌細胞，其原理是熒光素標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3′-OH末端，在熒光顯微鏡下熒光增強。隨機選取心肌組織區域中5個非重疊400高倍鏡視野，計數凋亡心肌細胞數和心肌細胞總數，心肌細胞凋亡率(%)=凋亡心肌細胞數/心肌細胞總數×100 %。(4)Caspase-3活性，Caspase-3可以催化底物DEVD-p-NA產生黃色的p-NA，從而可以通過測定吸光度來檢測caspase-3的活性；按照試劑盒說明書進行操作，混勻，405 nm，讀取各管OD值，根據標準曲線方程及光密度值計算樣品中caspase-3活性。

2 結 果

2.1 血漿內CK-MB水平 與假燙組[(585.6±46.1)U/L]比較，燙傷組傷后3、6 h血漿內CK-MB水平[(2552.9±145.3)U/L，(5418.7±292.9)U/L]明顯升高(均P<0.05),組間比較具有統計學差異；SAHA治療后，血漿內 CK-MB水平[(1642.4±157.2)U/L，(3475.3±187.5)U/L]較燙傷組明顯降低(均P<0.05)。

2.2 心肌組織含水率 燙傷后3、6 h，燙傷組心肌組織含水率[(77.65±1.75)%，(80.23±1.82)%]較假燙組[(70.12±1.99)%]明顯升高(均P<0.05),而SAHA組傷后心肌組織含水率[(72.31±1.95)%，(75.21±2.00)%]顯著低于燙傷組(均P<0.05)。

2.3 心肌組織TUNEL染色結果 正常心肌纖維排列整齊，肌纖維之間距離緊密，燙傷后, 心肌纖維出現扭曲、紊亂、斷裂，肌間質水腫、增寬，心肌細胞出現凋亡，傷后時間越長，心肌損傷越重；而給予SAHA處理后，心肌損傷較燙傷組明顯減輕, 肌纖維排列較整齊,間質水腫減輕，心肌細胞凋亡數量減少，說明SAHA能在一定程度保護心肌結構完整，保護心臟功能，抑制心肌細胞凋亡(圖1)。

圖1 各組心肌組織TUNEL染色(×400)

2.4 心肌細胞凋亡率 燙傷后3、6 h，燙傷組心肌細胞凋亡率[(16.1±0.8)%，21.5±1.2)%]明顯高于假燙組[(0.5±0.1)%]，具有統計學意義(均P<0.05)；隨傷后時間增加，心肌細胞凋亡率也隨之升高，而給予SAHA處理后，心肌細胞凋亡率[(11.6±0.6)%，(15.1±0.9)%]較燙傷組明顯降低(均P<0.05)。

2.5 心肌組織caspase-3活性 與假燙組[(0.435±0.041)μmol/mg]比較，燙傷組傷后3.6 h心肌組織內caspase-3活性[(0.716±0.052)μmol/mg，(0.912±0.063)μmol/mg]明顯升高(均P<0.05)，而SAHA組caspase-3活性[(0.557±0.052)μmol/mg，(0.535±0.034)μmol/mg]顯著低于燙傷組，組間比較差異具有統計學意義(均P<0.05)。

3 討 論

嚴重燒傷/失血性休克后，心肌早期就出現缺血缺氧性損傷，心臟功能減退，進而誘發或加重休克。早期心肌損傷的防治對休克的治療和減少并發癥具有重要意義。對不能及時得到系統治療的嚴重燒傷/失血性休克患者，如果在早期給予抗休克維持藥物，保護休克狀態下的心肌組織及心臟功能，對后續治療意義重大。

以往研究證實，在嚴重燒傷早期就已出現心肌損傷[2]，由于燒傷部位血管通透性增加，血漿大量滲出至體外或第三間隙，有效循環血量銳減，導致心肌細胞缺血缺氧、能量代謝障礙、炎性反應、心肌細胞水腫、心肌結構受損及心功能下降等一系列反應，加重休克甚至死亡。

SAHA作為一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，以往研究證實組蛋白去乙酰化酶抑制劑具有增加組蛋白的乙酰化水平，維持乙酰化動態平衡，具有促進基因轉錄、染色體重建、影響細胞分化、細胞保護、抗氧化、抗炎等作用[8-11]。燒傷后在心肌中，缺血、缺氧通過組蛋白H3/H4去乙酰化誘導組蛋白去乙酰化反應，組蛋白去乙酰化酶抑制劑能降低機體對缺血、缺氧性損傷的反應，在某種程度上阻斷了缺血缺氧誘導的基因程序的激活[12]。本實驗通過建立50%三度燙傷大鼠模型，觀察SAHA對心臟功能的影響，大鼠在致死性燙傷傷后，燙傷組CK-MB水平顯著升高，心肌組織含水率明顯增加，心肌水腫，心肌結構紊亂、斷裂，組織間隙水腫加重，而給予SAHA處理后，CK-MB水平較燙傷組明顯降低，心肌細胞水腫減輕，心肌纖維排列紊亂情況明顯好轉，說明SAHA能在一定程度上保護心肌功能，減輕心肌細胞水腫，保護心肌結構完整。

在缺血、缺氧誘導心肌損傷過程中，早期出現心肌細胞凋亡，影響心臟功能。沈帆等[13]證實，SAHA通過抑制氧化應激改善間歇性低氧小鼠的心肌損傷。Nagata等[14]證實，SAHA通過誘導心肌內熱休克蛋白表達，改善心臟功能，延緩心肌梗死后心力衰竭的發展。Yang等[15]證實，在小鼠缺血再灌注損傷模型中，SAHA可預防缺血再灌注引起的心肌內線粒體功能障礙和丟失，并減少缺血前后心肌ROS的產生，保護心臟功能。Caspase-3活性增加表明細胞出現凋亡，是細胞凋亡的重要檢測指標。在本實驗中，燙傷后心肌細胞出現凋亡，隨傷后時間增加，心肌細胞凋亡數量持續增加，而caspase-3活性也顯著升高，而給予SAHA治療后，心肌細胞凋亡數量明顯減少，caspase-3活性明顯降低。本研究表明， SAHA能保護致死性燙傷大鼠心臟功能，可能與抑制心肌細胞凋亡、caspase-3活性有關。

綜上所述，本實驗通過SAHA對50%TBSAⅢ度燙傷大鼠心臟功能的影響研究，證實SAHA能保護致死性燙傷大鼠心臟功能，降低CK-MB水平，減輕心肌組織水腫，其作用機制可能與降低心肌組織內caspase-3活性、抑制心肌細胞凋亡有關，但具體機制有待進一步研究。