基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤標(biāo)記物檢測中的研究進(jìn)展

逄璦博，李博安 綜述 田亞平 審校

泌尿生殖道癌是最常見的癌癥之一，包括膀胱癌、腎癌、前列腺癌等[1]。其中膀胱癌占所有新發(fā)癌癥的3%，占所有癌癥死亡人數(shù)的2%，男性的發(fā)病率是女性的3.4倍[2]。腎癌的發(fā)病率低于2%，但男性的發(fā)病率是女性的1.7倍，占所有癌癥死亡人數(shù)的2%[3]。前列腺癌是僅次于肺癌(占總數(shù)的14%)的第二大男性惡性腫瘤，是男性癌癥死亡的第四大原因，僅次于肺癌、肝癌、胃癌和結(jié)直腸癌[4]。

泌尿生殖道癌具有高發(fā)病率和死亡率，但早期診斷和治療可改善患者的預(yù)后。癌癥的發(fā)生與發(fā)展是非常復(fù)雜的過程，在一定程度上反映了患者之間的異質(zhì)性。盡管人類基因組計(jì)劃繪制了人類基因的圖譜，但對(duì)于大多數(shù)癌癥來說，僅使用基因組數(shù)據(jù)仍然不能預(yù)測癌癥的進(jìn)展和藥物治療療效?；虻暮塑账嵝蛄斜环g成具有多種功能的蛋白質(zhì)，包括催化代謝反應(yīng)、執(zhí)行DNA復(fù)制以及介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)外部刺激的反應(yīng)等，因此，表達(dá)蛋白的種類與數(shù)量可反映細(xì)胞的特性，使蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)成為腫瘤研究的重要工具之一。這些技術(shù)可以分析功能蛋白并檢測其在臨床樣本中的表達(dá)，對(duì)于監(jiān)測腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中特定蛋白表達(dá)的變化具有重要的臨床意義，蛋白質(zhì)組學(xué)也為腫瘤診斷、治療和其他臨床應(yīng)用的潛在生物標(biāo)記物研究提供了一種新方法[5]。質(zhì)譜是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要分析方法，通常與液相色譜、氣相色譜、離子遷移率和毛細(xì)管電泳等分離技術(shù)相結(jié)合，以提高峰容量，從而改善復(fù)雜生物體系樣品的分離、分析及檢測[6]。筆者介紹基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在膀胱癌、腎癌、前列腺癌腫瘤標(biāo)志物檢測中的研究進(jìn)展。

1 膀胱癌標(biāo)志物

對(duì)于膀胱癌的診斷，研究顯示載脂蛋白A1(apolipoprotein A1，APO A1)是一個(gè)潛在的生物標(biāo)記物。臨床研究顯示，尿液樣本通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測APO A1對(duì)膀胱癌診斷的總敏感性和特異性分別為94.6%和92.0%，曲線下面積(area under the curve，AUC值)為0.982，而Apo A1對(duì)早期膀胱癌的診斷敏感性和特異性分別為83.8%和94.0%，AUC值為0.978[7]。另一項(xiàng)研究表明，在雙向電泳質(zhì)譜分析(2 dimensional electrophoretic-mass spectrometry，2-DE MS)中，APO A1在膀胱癌患者和正常對(duì)照組的尿液中的表達(dá)也存在差異，APO A1診斷膀胱癌的敏感性和特異性分別為89.2%和84.6%，而脫落性尿細(xì)胞學(xué)聯(lián)合尿液Apo-A1檢測可進(jìn)一步顯著提高膀胱癌診斷的敏感性(93.7%)，表明Apo-A1可能是診斷膀胱癌的一個(gè)潛在的生物標(biāo)志物[8]。而轉(zhuǎn)膠蛋白2(Transgelin 2，TAGLN2)是最近在膀胱癌的蛋白質(zhì)組中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的生物標(biāo)記物，Chen等[9]通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS)共鑒定了3220個(gè)蛋白，選取其中7個(gè)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞中SLC3A2、STMN1和TAGLN2三種蛋白水平較非癌性膀胱上皮細(xì)胞顯著升高，提示TAGLN2可作為膀胱癌診斷(AUC=0.999)和評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有用的腫瘤組織標(biāo)志物。另外，ELISA結(jié)果顯示膀胱癌患者尿液中的STMN1和TAGLN2水平也均明顯高于對(duì)照組，其中膀胱癌尿液TAGLN2值變化最大(是對(duì)照組的7.13倍)，AUC為0.700，表明TAGLN2在單個(gè)膀胱癌組織和尿液樣本中的過度表達(dá)最為顯著，因此有可能成為膀胱癌非侵入性篩查的潛在生物標(biāo)志物。

有研究通過二維熒光差異凝膠電泳(two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis，2D-DIGE)和基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)鑒定了16種蛋白質(zhì)，包括膀胱癌患者和正常對(duì)照組尿液中的GC-球蛋白。結(jié)果顯示膀胱癌患者的GC -球蛋白明顯高于膀胱良性病變患者和正常對(duì)照組。ROC分析表明，以尿液中GC-球蛋白高于161.086 ng/mg為診斷標(biāo)準(zhǔn)，膀胱癌的檢測靈敏度為92.31%，特異性為83.02%，表明GC-球蛋白是一種潛在的新型尿液生物標(biāo)志物，可用于膀胱癌的早期檢測和監(jiān)測[10]。一項(xiàng)大規(guī)模、多中心的尿液多肽生物標(biāo)志物檢測膀胱癌的研究，將通過納入原發(fā)性膀胱癌患者(341例)和對(duì)照組(110例)以及復(fù)發(fā)性膀胱癌患者(109例)和相應(yīng)對(duì)照組(316例)，采用毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS)鑒定尿液多肽生物標(biāo)志物，并分別建立116個(gè)多肽與106個(gè)多肽分析模型，其中116個(gè)多肽模型檢測原發(fā)性膀胱癌的敏感性為91%，特異性為68%，AUC為0.87。106個(gè)多肽模型檢測復(fù)發(fā)性膀胱癌的敏感性為87%，特異性為51%，AUC為0.75，表明以尿液為基礎(chǔ)的尿液多肽檢測有望在門診對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行非侵入性檢測[11]。Krochmal等[12]研究顯示，在單肽水平上整個(gè)訓(xùn)練集顯示36種多肽是疾病復(fù)發(fā)的獨(dú)立診斷標(biāo)志物，在測試隊(duì)列中也顯示該模型對(duì)膀胱癌的復(fù)發(fā)具有顯著的診斷意義，且將尿液多肽整合到診斷模型中可以進(jìn)行膀胱癌復(fù)發(fā)的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，表明尿液多肽分析在臨床治療中具有重要價(jià)值。

在篩選血液標(biāo)志物的研究中，Lemańska-Perek等[13]則通過膀胱癌患者的血液標(biāo)本，結(jié)合圖像凝膠分析和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF)，繪制尿路上皮癌患者血漿蛋白質(zhì)組圖譜，并與正常標(biāo)本進(jìn)行比較，通過分析區(qū)分出3組與正常樣品不同的蛋白質(zhì)：第一組包括正常血漿中不存在的血漿轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維蛋白原γ和補(bǔ)體C3b的修飾形式，第二組包括結(jié)合珠蛋白、α-2-巨球蛋白、維生素D結(jié)合蛋白和色素上皮衍生因子(大量存在于癌組織中)。第三組由免疫球蛋白M的3種分子形式組成，其在膀胱癌患者血漿樣品中顯著降低，表明血漿生物標(biāo)記物與伴隨膀胱癌的炎性反應(yīng)、免疫和凝血過程有關(guān)，有望用于臨床測試。而在篩選腫瘤標(biāo)本標(biāo)志物的研究中，通過LC-MS對(duì)膀胱癌標(biāo)本(117例原發(fā)性膀胱癌)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，其中98例為非肌層浸潤性膀胱癌(non muscle invasive bladder cancer，NMIBC)患者、19例為MIBC患者，結(jié)果共篩選出三種NMIBC蛋白亞型(NMIBC proteomic subtype，NPS)：NPS1與低分化相關(guān)，NPS2與中分化相關(guān)，NPS3與高分化相關(guān)，且NPS1與MIBC蛋白組關(guān)系密切，而NPS3與MIBC蛋白組無關(guān)，表明腫瘤組織中的NPS可用于對(duì)膀胱癌患者惡性程度的分析[14]。

在膀胱癌鑒別診斷中，反應(yīng)性尿路上皮異型性的膀胱炎和原位癌(carcinoma in situ，CIS)之間的組織病理學(xué)鑒別較困難，有研究基于LC-MS的蛋白質(zhì)組分析對(duì)膀胱炎和浸潤性高級(jí)別尿路上皮癌標(biāo)本進(jìn)行研究，其中AHNAK2可區(qū)分膀胱炎和膀胱原位癌，其敏感性為97%，特異性為69%，表明AHNAK2可以區(qū)分急慢性膀胱炎的反應(yīng)性尿路上皮異型性改變和膀胱原位癌[15]。

2 腎癌標(biāo)志物

腎細(xì)胞癌是成人腎臟最常見的腫瘤，約占所有腎臟惡性腫瘤的90%?；顧z是確診腎癌的關(guān)鍵，但活檢是一種有創(chuàng)性的手術(shù)，成功率為70%～80%，且通過腎活檢獲得的腎組織通常是有限的，在某些情況下，也可能無法確診。非侵入性尿液生物標(biāo)志物的鑒定有助于指導(dǎo)治療決策，減少過度治療。Di Meo等[16]通過納入33例腎嗜酸細(xì)胞瘤(直徑≤4 cm)，30例進(jìn)展性和26例非進(jìn)展性Pt1a期腎透明細(xì)胞癌(腎臟兩級(jí)直徑≤4.0 cm)，以及26例健康對(duì)照，通過LC-MS蛋白質(zhì)組學(xué)方來識(shí)別和驗(yàn)證腎細(xì)胞癌的早期非侵入性尿液生物標(biāo)志物，并評(píng)估了115例尿液樣本。結(jié)果顯示有6種蛋白在透明細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組(其中GLRX和CST3蛋白的診斷性能最好)，且與低表達(dá)的腎細(xì)胞癌患者相比，CST3高表達(dá)的患者存活率明顯更低。另外，C12ORF49和EHD4蛋白在透明細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于腎嗜酸細(xì)胞瘤，EPS8L2、CHMP2A、PDCD6IP、CNDP2和CEACAM1蛋白在進(jìn)展期腎透明細(xì)胞癌表達(dá)又顯著高于非進(jìn)展期，而其中EPS8L2聯(lián)合CCT6A對(duì)于進(jìn)展期與非進(jìn)展期腎透明細(xì)胞具有較強(qiáng)的鑒別能力(曲線下面積為0.81)，且I-IV期患者EPS8L2和CCT6A mRNA發(fā)生改變的患者總生存期明顯短于未發(fā)生改變的患者，表明尿蛋白的蛋白組學(xué)分析有利于早期腎細(xì)胞癌進(jìn)展情況的分析，有利于臨床對(duì)患者進(jìn)行更有效的治療。Stella等[17]則進(jìn)一步研究了與透明細(xì)胞腎癌腫瘤分級(jí)相關(guān)的蛋白改變，通過MALDI-MSI進(jìn)行分析，最終確定了波形蛋白和三個(gè)組蛋白(H2A、H3和H4)，它們能夠區(qū)分4個(gè)不同級(jí)別的透明細(xì)胞腎癌。

而通過血清學(xué)方法對(duì)腎癌的早期無癥狀診斷和監(jiān)測治療效果也至關(guān)重要。Kaysheva等[18]通過納入36例腎癌患者與20例健康志愿者采集血漿進(jìn)行質(zhì)譜分析，對(duì)腎癌患者和健康志愿者血漿樣本的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行比較分析顯示，兩組患者大部分蛋白質(zhì)都位于細(xì)胞外，患者血漿中識(shí)別出的蛋白質(zhì)水平要高出20%～50%，但對(duì)照樣品和腎癌患者血漿樣本在蛋白質(zhì)組成上相似，腎癌患者中70%～80%的鑒定結(jié)果與對(duì)照組一致，且蛋白質(zhì)的生物過程高度相似，同時(shí)對(duì)于免疫狀態(tài)的蛋白質(zhì)也沒有顯著的差異性，因此，血漿檢測對(duì)于腎癌患者的篩查可能目前仍無法實(shí)現(xiàn)。但Chinello等[19]則將尿液與血漿蛋白檢測結(jié)合用于腎癌的研究，該研究通過納入血管浸潤性腎細(xì)胞癌的患者，通過nLC-ESI-MS在尿液和血漿中鑒定出1207和156個(gè)蛋白；且分別有574種尿蛋白和58種血漿蛋白與腎癌血管受累相關(guān)，但隨著血管受累程度的加重，尿中僅有3種蛋白(UROM、Rala、CNDP1)和2種血漿蛋白(APO A1、K2C1)的降低，且26種尿蛋白升高。其中載脂蛋白A-1(APO A1)被證明與腎癌預(yù)后相關(guān)，即低APOA1血清水平與較差的總體生存率和較短的無病生存期相關(guān)。正常尿液與血液中部分蛋白質(zhì)存在重疊，但當(dāng)腎靜脈受累時(shí)，血漿與尿液中蛋白重疊性減低，因此，對(duì)于腎癌累計(jì)血管的患者，尿液與血漿蛋白的檢測具有互補(bǔ)性，可提高檢測效能。

在腎癌腫瘤組織的檢測中，陳壯飛等[20]采用熒光差異雙向凝膠電泳技術(shù)篩選癌旁正常腎組織及腎透明細(xì)胞癌差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，然后通過質(zhì)譜技術(shù)鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)。結(jié)果顯示，經(jīng)質(zhì)譜技術(shù)共鑒定出26種差異表達(dá)蛋白質(zhì)(15種蛋白質(zhì)在腎癌組織中下調(diào)，11種蛋白質(zhì)上調(diào))，其中醛糖1-表異構(gòu)酶、酰基輔酶A脫氫酶、CAPG、微纖絲相關(guān)糖蛋白4PRDX4、β-防御素107是首次采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)成功篩選的腎癌差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)了1個(gè)預(yù)測蛋白(UCRIL)，表明上述差異表達(dá)蛋白有望成為腎癌分子生物學(xué)標(biāo)記物。

3 前列腺癌標(biāo)志物

血清PSA是前列腺癌(prostate cancer，PCa)的特異性標(biāo)志物，因此有研究通過使用基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析聯(lián)合血清PSA檢測對(duì)PCa進(jìn)行診斷，其中神經(jīng)肽Y聯(lián)合PSA檢測PCa的敏感性為81.5%，特異性為82.2%，AUC值為0.88[21]；CD14聯(lián)合PSA的敏感性為81%-94%，特異性為84%-100%[22]。Ummanni等[23]在PCa患者血清中發(fā)現(xiàn)抗過氧化物氧化還蛋白6和膜聯(lián)蛋白A11的自身抗體也可作為PCa的診斷指標(biāo)，可用于PCa患者的鑒別，上述兩種抗體單獨(dú)檢測的敏感度在70%-80%，而兩種抗體聯(lián)合使用對(duì)PCa的診斷敏感度90%、特異度100%。

血清PSA的連續(xù)升高是進(jìn)展性疾病的敏感指標(biāo)，ADT治療后7個(gè)月的血清PSA下降已被觀察到與長期反應(yīng)有一定程度的關(guān)聯(lián)，但目前還無證據(jù)顯示PSA治療前的水平可作為預(yù)測標(biāo)記物。而Kohli等[24]通過反相液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的方法，研究了激素敏感型PCa患者的血清蛋白質(zhì)組，以確定與雄激素剝奪治療療效相關(guān)的候選生物標(biāo)志物，結(jié)果顯示17-β-雌二醇、活化B細(xì)胞復(fù)合體的核因子κ輕鏈增強(qiáng)子和P38絲裂原活化蛋白激酶可能是雄激素剝奪治療反應(yīng)的潛在預(yù)測標(biāo)記物。

在PCa中，Gleason分級(jí)常用于評(píng)估PCa患者的預(yù)后，但該方法常需要活檢，有研究探討與Gleason評(píng)分相關(guān)的新型蛋白質(zhì)組生物標(biāo)記物用于PCa侵襲性的預(yù)測。其中Al-Ruwaili等[25]使用表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)分別對(duì)低Gleason評(píng)分和高Gleason評(píng)分PCa患者的血清蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果顯示共鑒定18個(gè)差異表達(dá)蛋白可用于鑒別侵襲性與惰性PCa，且敏感性與特異性分別為70%、62.5%。Fujita等[26]則通過檢測尿液蛋白發(fā)現(xiàn)尿液中的脂肪酸結(jié)合蛋白5在PCa組高于陰性組，且與Gleason評(píng)分顯著相關(guān)，且ROC曲線顯示脂肪酸結(jié)合蛋白5預(yù)測Gleason評(píng)分>6的PCa的AUC值為0.757，顯著高于血清PSA預(yù)測的AUC值(0.593)，因此尿脂肪酸結(jié)合蛋白5可作為高Gleason評(píng)分PCa的潛在生物標(biāo)志物。Kwon等[27]通過串聯(lián)質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)胰蛋白酶多肽進(jìn)行分析，以鑒定突變多肽作為晚期PCa的新生物標(biāo)志物，結(jié)果顯示INTS7水平的升高和SH3BGRL水平的降低也與PCa的侵襲性有關(guān)，而在PCa細(xì)胞系中鑒定出70個(gè)突變肽，其中7種突變肽在腫瘤組織中的表達(dá)發(fā)生了變化，而CAPN2 D22E是PCa組織中表達(dá)上調(diào)最顯著的突變肽，表明PCa組織中存在的突變肽也可作為晚期PCa的標(biāo)志物[28]。

PCa常需要與良性前列腺增生進(jìn)行鑒別，而Totten等[29]通過定量蛋白組質(zhì)譜方法和多聯(lián)凝集素親和色譜研究了血清蛋白及其糖型，結(jié)果顯示，與良性前列腺增生對(duì)比，PCa樣本中CFP、C8A、CD5L、C7、BST1顯著增加，且C4BPB 和AZGP1糖基類型也存在變異，可用于PCa的鑒別診斷。

研究顯示，腫瘤的基因拷貝數(shù)、DNA甲基化和mRNA表達(dá)水平的差異并不能可靠地預(yù)測蛋白質(zhì)組的變化，因此在蛋白質(zhì)水平上沒有功能效應(yīng)，表明蛋白質(zhì)組對(duì)于腫瘤生長及進(jìn)展的分子機(jī)制研究具有重要意義[30]。而上述早期研究結(jié)果也表明，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)有望成為臨床泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤檢測、早期診斷或鑒別診斷、預(yù)后分析、療效評(píng)估等的篩查或檢測工具。

隨著基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)不斷改進(jìn)，將會(huì)有更多的生物標(biāo)志物候選在血液或尿液樣本中被檢測，用于非侵入性的臨床應(yīng)用。盡管使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了許多新的候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，但不同生物標(biāo)記物聯(lián)合檢測腫瘤比單一標(biāo)記物更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)閱我粯?biāo)記物的檢測通常有明確的臨界濃度值，且該領(lǐng)域目前仍處于生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)階段，可獲得的相關(guān)研究仍然有限，未來需要更多的研究以評(píng)估新型生物標(biāo)記物的有效性和經(jīng)濟(jì)性等方面。