有氧運動對自發性高血壓大鼠腎臟纖維化的影響

彭 朋，秦永生，王大寧，馬 剛，何瑞波，劉佰川，李應森，何瑞波

心血管疾病是人類健康的頭號殺手，高血壓則是最常見的心血管疾病，可導致多個靶器官(心、腦、腎等)損害[1]；腎臟是最常累及的器官之一，稱為高血壓腎病[2]。持續血壓升高通過降低入球小動脈阻力并增加出球小動脈阻力引起腎小球毛細血管壓力升高(腎小球高壓)，進而造成腎臟纖維化甚至腎硬化，直至腎臟完全喪失臟器功能[2]。纖維化是細胞外基質過度沉積和積聚的結果，研究證實，轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)/Smad是介導細胞外基質合成的經典信號通路，高血壓腎病腎臟發生纖維化并伴隨TGF-β1/Smad信號途徑持續激活[3]。近年來的研究發現，高血壓腎病時腎小管上皮細胞向具有細胞外基質分泌能力的肌成纖維細胞轉化，即上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transdifferentiation，EMT)，是腎臟纖維化形成與進展的重要病理生理機制[3]。有證據顯示，TGF-β1/Smad能夠正向調控EMT，形成“TGF-β1/Smad-EMT-腎臟纖維化”病理過程，因此抑制TGF-β1/Smad信號通路介導的EMT是防治腎臟纖維化的重要靶點[4]。

有規律的體力活動對心血管疾病患者具有多種健康效應，其中有氧運動是主要方式[5]。有關規律運動對各種原因導致的腎臟疾病的作用鮮有關注，課題組前期的研究發現，有氧運動能夠改善自發性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)腎臟膠原過度沉積，其機制與減輕炎癥反應有關[6]。本研究以SHR為模型，觀察有氧運動對腎臟纖維化的影響并探討腎小管EMT以及TGF-β1/Smad信號途徑在其間的作用機制，為高血壓腎病患者制定有針對性的運動處方提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 40只12周齡雄性Wistar-Kyoto大鼠和SHR，體重(209±12)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。將10只Wistar-Kyoto大鼠作為正常血壓對照組(WKY)；30只雄性SHR按照隨機數字表法分為高血壓安靜組(SHR sedentary，SHR-S)和高血壓運動組(SHR exercise，SHR-E)，每組15只。動物分籠(5只/籠)標準飼料飼養，自由進食水。WKY和SHR-S組在鼠籠內安靜飼養，SHR-E組進行8周跑臺運動。由于拒跑(SHR-E組1只)、意外死亡(SHR-S組3只，SHR-E組1只)等原因，納入統計的最終樣本量為：WKY組(n=10)、SHR-S組(n=12)、SHR-E組(n=13)。

1.2 運動方案 所有動物先進行5 d跑臺適應性訓練，方案為：速度10～15 m/min，坡度0°，時間15～30 min/d。隨后參照課題組前期建立的方法[6, 7]測定大鼠運動能力：起始負荷5 m/min，坡度0°，每2 min增加1.5 m/min，直至力竭，記錄最大跑速(maximal velocity，Vmax)。隨后SHR-E組大鼠進行8周跑臺運動，速度為60%Vmax對應的跑速，持續時間為60 min/次，5次/周。第2、4、6周重新測定Vmax并調整運動強度。

1.3 血壓水平測定 末次訓練后72 h(避免急性運動的影響)，利用無創血壓測量儀(BP-2010E，日本)檢測大鼠尾動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)并計算平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)，測量3次取均值。

1.4 組織取材 血壓水平測定后將大鼠置于代謝籠中24 h收集尿液。稱重后腹腔麻醉動物，隨即分離左側腎臟，將其分為兩部分，一部分用于組織病理學觀察，另一部分進行分子生物學檢測。

1.5 腎臟功能測定 尿樣于4 ℃、3000 r/min離心15 min后取上清，利用全自動生化分析儀(AU680，美國)檢測血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)含量，分光光度計(722 型，上海)測定24 h尿蛋白(urine protein，UP)含量。

1.6 腎臟病理組織學觀察 取腎臟組織經4%甲醛溶液固定12 h后經脫水、包埋、制作4 μm組織切片。脫臘后進行Masson染色，中性樹膠封片。倒置相差顯微鏡(歐林巴斯IX71，日本)下每張切片選取10個視野，觀察膠原沉積情況，用圖像分析軟件(Image Pro Plus 6.0，美國)測量結締組織面積與所測視野面積的比值作為腎臟纖維化指數(fibrosis index，FI)。

1.7 蛋白水平檢測 利用Western blot法檢測腎臟TGF-β1、磷酸化Smad2(p-Smad2)、p-Smad3、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-CA)表達量。腎臟組織勻漿后4 ℃、12 000 g離心10 min，取上清，考馬斯亮藍測定總蛋白質濃度。取100 μg蛋白樣品在垂直電泳儀上經10% SDS-PAGE分離蛋白質，隨后轉移至PVDF膜上。兔抗鼠一抗[TGF-β1(1∶2000，Santa cruz公司)、p-Smad2(1∶1000，Abcam公司)、p-Smad3(1∶1000，Abcam公司)、α-SMA(1∶2000，Santa cruz公司)、E-CA(1∶2000，Santa cruz公司)]4 ℃靜置孵育過夜，二抗(1∶5000，武漢博士德生物工程有限公司)37 ℃孵育2 h。充分洗滌后，ECL發光成像，利用凝膠成像系統(ChemiDoc XRS，美國)拍攝并掃描各條帶灰度值。將各組與β-actin(1∶10000，Abcam公司)灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 血壓水平的變化 與WKY組比較，SHR-S組SBP、DBP和MAP均顯著性升高(P<0.05)；與SHR-S組比較，SHR-E組各血壓水平降低(P<0.05，表1)。

表1 三組大鼠末次有氧運動后72 h血壓水平的變化

2.2 腎臟功能的變化 腎臟結構與功能檢測顯示，與WKY組比較，SHR-S組UP、BUN和SCr升高(P<0.05)；與SHR-S組比較，SHR-E組UP、BUN和SCr下降(P<0.05，表2)。

表2 三組大鼠末次有氧運動后72 h腎臟功能的變化

2.3 腎臟組織病理學觀察與纖維化指數(fibrosis index，FI)的變化 三組大鼠末次訓練后72 h腎臟組織病理變化見圖1，腎實質細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色。WKY組腎小球和腎小管形態結構正常，間質中僅有少量膠原纖維；SHR-S組腎小球萎縮，腎小管管腔擴張，間質增厚并存在大量膠原纖維，FI高于WKY組[(7.87±1.89)%vs.(0.43±0.05)%，P<0.05]；SHR-E組腎小球、腎小管病變減輕，膠原纖維明顯減少，FI較SHR-S組降低[(3.02±0.91)%vs.(7.87±1.89)%，P<0.05]。

圖1 三組大鼠末次有氧運動后72 h腎臟組織病理變化(Masson，×400)

2.4 蛋白表達量的變化 與WKY組比較，SHR-S組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表達量上調(P<0.05)，E-CA蛋白表達下調(P<0.05)；與SHR-S組比較，SHR-E組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表達下調(P<0.05)，E-CA蛋白表達上調(P<0.05，表3)。

表3 三組大鼠末次有氧運動后72 h蛋白表達量的變化

3 討 論

臨床研究證實，高血壓腎病表現為細胞外基質在腎間質過度沉積，腎單位逐漸減少，腎小球濾過率和腎功能進行性下降，最終發生腎衰竭和尿毒癥[2]。本研究以SHR為模型，結果發現，SHR-S組動物腎臟FI、UP、BUN和SCr均較WKY組升高，提示高血壓誘導大鼠腎臟發生纖維化，腎功能降低。規律體力活動對多種原因引起的組織纖維化均具有改善效應[8]。課題組前期的研究證實，8周有氧運動可改善高血壓大鼠心肌纖維化，但運動對腎臟纖維化的影響鮮有關注[7]。本研究發現，經過8周跑臺運動后，SHR-E組腎臟FI、UP、BUN和SCr較WKY組顯著性下降，這與以游泳運動[9]、力量訓練[10]為干預方式的研究結果基本一致，說明不同運動方式均可減輕腎臟膠原沉積并改善腎臟功能，提示運動療法作為高血壓腎病的輔助治療手段，患者應長期堅持。

TGF-β1是促進組織纖維化最重要的調控因子[11]。在受到炎性反應、氧化應激等致病因素作用后，腎臟可誘導靶細胞產生TGF-β1，與相應膜受體結合磷酸化細胞內信號分子Smad2和Smad3進而使其活化，活化(磷酸化)的Smad2/3與 Smad4結合為三聚體并進入胞核內，通過誘導促纖維化因子如結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)基因表達而刺激成纖維細胞增殖，最終導致腎臟纖維化[11]。近年來的研究指出，TGF-β1/Smad2/3信號通路介導的腎小管EMT是腎臟間質纖維化的重要病理生理機制，通常表現為細胞抗凋亡及遷移能力增強，且可大量分泌細胞外基質[12-14]。在EMT進程中，腎小管上皮細胞喪失上皮細胞黏附特性，即表皮黏附分子E-CA表達減少，同時重新表達 α-SMA等間充質細胞表型。

在本研究中，與WKY組比較，SHR-S組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表達量上調，E-CA蛋白表達量下調，說明高血壓大鼠腎臟TGF-β1/Smad信號通路持續激活并誘導腎小管發生EMT。臨床研究證實，抑制腎小管EMT能夠延緩腎臟疾病的進展并維持腎臟正常形態和功能[14, 15]。在本研究中，經過跑臺訓練后，與SHR-S組比較，SHR-E組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表達量下調，E-CA蛋白表達量上調，提示有氧運動能夠顯著降低TGF-β1/Smad信號活性并抑制該信號途徑誘導的腎小管EMT，因此TGF-β1/Smad-EMT可能是運動改善SHR腎臟纖維化的重要靶點。

綜上所述，大鼠發生高血壓時腎臟TGF-β1/Smad信號途徑持續激活并誘導腎小管EMT和腎臟纖維化，腎功能進行性下降；有氧運動可能通過調控TGF-β1/Smad信號途徑(下調其活性)抑制高血壓腎病大鼠腎小管EMT，進而改善腎臟纖維化并提高腎功能。