1,25(OH)2D3對關節滑膜蛋白聚糖-4基因表達及分泌的影響

王志強,關超玲,朱 輝,李賢慧

骨性關節炎(Osteoarthritis，OA)是中老年常見的關節疾病，而且目前國內外尚缺乏療效確切的藥物[1]。骨性關節炎病程進展非常緩慢，在核磁共振或X線放射照相能檢出半月板或關節軟骨損傷之前，病理損傷僅僅是韌帶退化、滑膜炎等早期癥狀[2]。這種緩慢退化時間可長達4年以上[3]，這是非常重要的預防保健窗口期，如能采取有效措施或許可以恢復健康[4]。研究表明骨性關節炎最早的病理改變是關節液中重要潤滑分子透明質酸和蛋白聚糖-4分泌減少，但分泌減少的原因目前尚不清楚[5]。筆者前期研究表明1,25(OH)2D3對關節滑膜的分泌功能有調節作用，能促進透明質酸的分泌[6]。蛋白聚糖4(proteoglycan 4, PRG4)和透明質酸均是關節滑液中的重要分子，對保持關節滑液的邊界潤滑功能起決定作用。本研究旨在探討1,25(OH)2D3對關節滑膜PRG4基因表達及分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器試劑 EL311SX 酶聯免疫檢測儀；7700型定量PCR儀，美國ABI公司；兔蛋白聚糖-4 ELISA試劑盒為美國Abcam公司產品；1,25(OH)2D3為Sigma公司產品；TrizolTM試劑為Invitrogen公司產品。

1.2 兔膝關節滑膜組織分離培養 健康7月齡新西蘭大白兔，體重(3.3±0.2)kg，常規技術取滑膜，放入6孔培養板中培養。

1.3 1,25(OH)2D3對關節滑膜PRG4基因表達和滑膜分泌PRG4影響的時間譜分析 根據筆者前期獲得的實驗數據，選擇1,25-(OH)2D3終濃度為10 nM進行時間譜分析。新分離滑膜普通培養24 h后，滑膜培養液中加入1,25-(OH)2D3進行實驗。滑膜PRG4基因表達量和滑膜分泌PRG4進入培養液的量可同時分析。按作用時間分為七組，分別為0 h(對照)，12、24、36、48、60、72 h組。在指定時間分別收取滑膜培養液和滑膜。滑膜培養液直接進行ELISA實驗，檢測培養液中PRG4分泌量的變化。滑膜進行總RNA提取，后續進行 Real time-PCR分析PRG4基因表達量。

1.4 1,25(OH)2D3濃度對關節滑膜PRG4基因表達和滑膜分泌PRG4的影響分析 根據時間譜分析結果選擇最佳時間，分析不同1,25-(OH)2D3作用濃度對關節滑膜PRG4基因表達和滑膜分泌PRG4的影響。按1,25(OH)2D3作用濃度分為六組：0 nM(對照)，0.1、1、10、50、100 nM。在指定時間分別收取滑膜培養液和滑膜，滑膜培養液直接進行ELISA實驗，檢測培養液中PRG4分泌量的變化。滑膜進行總RNA提取，再進行Real time-PCR分析PRG4基因表達量。

1.5 Real time-PCR分析PRG4基因表達 利用Invitrogen公司的Trizol試劑按說明書步驟進行滑膜總RNA的提取。實驗中所用離心管及移液器槍頭均為Axygen無RNA酶產品。反轉錄反應合成cDNA，將2 μg總RNA與2 μl隨機引物(0.5 g/L)混合，加DEPC水補足至終體積12.5 μl。70 ℃水浴變性5 min，然后立刻置冰上5 min；每管中再加入下列試劑：M-MLV 5×Reaction buffer 4 μl，dNTP(10 mM)2 μl，RNasin(40 U/μl)0.5 μl，M-MLV(200 U/μl)1 μl。混勻，瞬時離心，37 ℃反應1 h。70 ℃滅活5 min，離心1 min，保存于-70 ℃備用。

Realtime-PCR反應體系：PRG4基因引物序列，Forward 5′ CAGGCTTGGAAGATGGTGGT3′，Reverse 5′CTTTTTGGCTAGATTCGGCCC 3′，產物長度167 bp；內參基因GAPDH的引物序列，Forward 5′CCAGCCTCGTCCCGTAGACA 3′，Reverse 5′CCGTTGAATTTGCCGTGAGT3′，產物長度189 bp。

1.6 ELISA檢測培養液中PRG4分泌量的變化 用包被緩沖液(pH9.6 0.05 M碳酸鹽緩沖液)將抗兔PRG4抗體稀釋至1 μg/ml，在96孔酶標板每孔加100 μl，4 ℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 min。加樣：加入收取的滑膜培養液100 μl，37 ℃孵育2 h，洗滌緩沖液洗3次。加酶標抗體：加1X生物素化PRG4抗體、1X HRP酶親和素各100 μl，37 ℃孵育2 h，洗滌3次。加入顯色底物(TMB)100 μl，37 ℃孵育30 min，反應終止液50 μl。450 nm波長處測OD值，PRG4濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣品中PRG4的濃度。

2 結 果

2.1 1,25(OH)2D3對關節滑膜PRG4基因表達影響的時間譜分析 Real time-PCR分析結果顯示，1,25(OH)2D3作用6 h后PRG4 mRNA表達水平開始上調，12 h時PRG4 mRNA表達水平繼續升高，24 h時PRG4 mRNA表達水平達峰值，48 h后PRG4 mRNA水平開始降低(表1)。

表1 1,25(OH)2D3作用不同時間PRG4 mRNA表達水平

2.2 1,25(OH)2D3對關節滑膜分泌PRG4蛋白影響的時間譜分析 ELISA法PRG4蛋白定量分析表明，1,25(OH)2D3作用6 h后滑膜培養液中PRG4蛋白含量與對照組相比差異無統計學意義；12 h時滑膜培養液中PRG4蛋白含量明顯升高，差異有統計學意義；24 h時滑膜培養液中PRG4蛋白含量繼續升高，48～72 h滑膜培養液中PRG4蛋白含量達高峰平臺期，見表2。

表2 1,25(OH)2D3作用不同時間PRG4蛋白分泌變化

2.3 1,25(OH)2D3濃度對關節滑膜PRG4基因表達的影響 Real time-PCR分析結果顯示，0.1～100 nM濃度的1,25(OH)2D3均明顯促進關節滑膜PRG4基因表達，與空白對照相比差異有統計學意義。在0.1～100 nM濃度范圍內，PRG4基因表達上調幅度與1,25(OH)2D3的濃度正相關(表3)。

表3 不同濃度1,25(OH)2D3對PRG4 mRNA表達水平的影響

2.4 1,25(OH)2D3濃度對關節滑膜分泌PRG4蛋白的影響 根據實驗結果，1,25(OH)2D3作用48 h后滑膜培養液中PRG4蛋白分泌量達高峰，因此選為最佳時間點。ELISA檢測滑膜培養液中PRG4蛋白含量結果顯示，0.1～100 nM 濃度的1,25(OH)2D3均明顯促進關節滑膜PRG4蛋白分泌，并且在0.1～100 nM濃度范圍內，PRG4蛋白分泌上調幅度與1,25(OH)2D3的濃度正相關(表4)。

表4 不同濃度1,25(OH)2D3對PRG4蛋白表達水平的影響

3 討 論

滑膜是一層緊貼關節囊內襯面的膜狀結構，主要的功能是分泌滑液。滑膜通過分泌關節滑液(synovial fluid，SF)營養關節軟骨，潤滑關節面，減少關節運動時摩擦。充足的關節液是保護關節軟骨和關節面不受磨損和沖擊的關鍵[7]。在關節滑液中起潤滑和緩沖作用的重要分子是透明質酸(hyaluronic acid,HA)和PRG4。透明質酸是滑液流變性能的基礎分子，而蛋白聚糖是關節滑液邊界潤滑功能的關鍵分子[8]。PRG4 是一種大分子蛋白多糖，是關節液的重要組成部分，具有介導邊界潤滑、緩沖關節負荷、降低摩擦力等作用。PRG4中間段有豐富的O連接，可以結合豐富的糖基。在關節滑液中，PRG4、HA和表面活性磷脂通過分子間相互作用從而使關節滑液既黏稠又有良好的彈性和抗壓性。

多項研究表明，維生素D缺乏與嚴重骨關節炎密切相關，特別是中老年人[9]；維生素D缺乏也與骨關節炎進展相關[10]。1,25(OH)2D3主要通過核受體VDR(vitamin D receptor, VDR)和膜受體Pdia-3轉導實現[11]。本研究中，1,25(OH)2D3分別在作用6 h和12 h后檢測到PRG4 mRNA表達和滑膜培養液中PRG4蛋白上調，說明不是膜受體Pdia-3瞬時轉導效應，筆者推測1,25(OH)2D3調節PRG4基因表達及蛋白分泌的機制可能主要是通過核受體VDR實現。

流行病學研究表明，維生素D缺乏與骨關節炎相關性很高，而且補充維生素D可緩解骨性關節炎病情[9，10]，但分子機制不清楚。骨性關節炎最早的病理改變是關節液中重要潤滑分子透明質酸和PRG4分泌減少，本實驗數據表明，1,25(OH)2D3不僅能增加關節滑膜分泌透明質酸的能力[6],也能增加關節滑膜分泌PRG4的能力，這提示1,25-(OH)2D3可能是調節關節滑膜分泌的重要因素。這也提示缺乏1,25(OH)2D3是骨性關節炎可能的重要因素之一，早期補充維生素D可能對預防骨性關節炎有重要作用。