miR-424-5p靶向PHD2對骨性關節炎軟骨細胞凋亡及炎癥因子分泌的影響

符傳恭， 陸志夫， 宋世鋒，黃 健，茍學健

1)海口市中醫醫院骨科 海口 570000 2)海南醫學院第二附屬醫院骨二科 海口 570000

骨性關節炎是由關節退化引起的一種以關節軟骨發生破壞為主的慢性關節病，常發生于中老年人。該病嚴重者需要進行關節置換或截骨術，嚴重影響中老年患者的晚年生活質量[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA) 由18～22個核苷酸組成，其通過抑制靶mRNA的轉錄或蛋白翻譯在多種疾病中發揮重要作用[3]。很多miRNA在骨性關節炎軟骨細胞中異常表達，并參與骨性關節炎的發展，其中包括miR-424-5p[4]，但是其在骨性關節炎中的作用尚不十分清楚。脯氨酸羥化酶2(proline hydroxylase 2，PHD2)屬于PHDs家族，在骨修復、骨再生、炎癥、造血中發揮著重要作用[5]，推測PHD2、miR-424-5p可能參與骨性關節炎的調控。本研究擬以成人骨性關節炎軟骨細胞HC-OA為研究對象，檢測其中miR-424-5p、PHD2的表達，觀察過表達miR-424-5p、過表達PHD2對HC-OA細胞凋亡、炎癥因子分泌的影響，為骨性關節炎的治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料成人軟骨細胞HC購自美國Scien Cell公司，HC-OA購自Sigma公司。胎牛血清購自杭州四季青公司，411K-500培養基購自美國Cell Applications公司，RNA抽提試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自TaKaRa公司，IL-6、IL-1β、IL-17 ELISA檢測試劑盒，蛋白裂解液，ECL發光劑均購自上海碧云天生物技術有限公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司，Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物科技公司，兔抗人PHD2多克隆抗體購自上海瑤韻生物公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自美國Abcam公司，miR-424-5p模擬物、miR-NC購自廣州銳博生物公司，pcDNA、pcDNA-PHD2購自上海吉瑪基因公司。

1.2細胞培養HC和HC-OA細胞用含體積分數15%胎牛血清的411K-500培養基在37 ℃、體積分數5%CO2的細胞培養箱中常規培養、傳代。

1.3HC和HC-OA中miR-424-5p及PHD2mRNA和蛋白表達的檢測采用qRT-PCR法檢測細胞中miR-424-5p和PHD2 mRNA的表達。用RNA抽提試劑盒提取細胞中總RNA，反轉錄成cDNA。miR-424-5p上游引物5’-ATAAGATCTGGCTCCAC CTGCAGCTCCTGGAAATC-3’，下游引物5’-ATAAGATCTGCGCCCCAGCCTAGCCAGGAATAC-3’；PHD2上游引物5’-GCACGACACCGGGAAGTT-3’ ，下游引物5’-CCAGCTTCCCGTTACAGT-3’；U6 上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；GAPDH上游引物5’-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3’，下游引物5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’。引物均由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。PCR反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補足至20 μL。反應條件:95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，共循環40次。以U6、GAPDH為內參，用2-ΔΔCt法計算miR-424-5p、PHD2 mRNA的表達。實驗重復3次。

采用Western blot法檢測細胞中PHD2蛋白的表達。分別收集HC細胞與HC-OA細胞，加入RIPA裂解液充分裂解，提取總蛋白，定量后沸水浴變性10 min，1 000 r/min離心1 min后取上清進行蛋白電泳、轉膜、封閉和抗體孵育，一抗(兔抗人PHD2多克隆抗體)按1∶500稀釋，二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG)按1∶1 000稀釋。用超敏ECL發光試劑盒進行顯影曝光。以GAPDH為內參，Quantity One 4.62分析PHD2蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.4miR-424-5p與PHD2靶向關系的預測及驗證根據生物信息學在線預測軟件Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)預測miR-424-5p與PHD2之間的靶向結合位點。由上海吉瑪公司設計合成含PHD2 3’UTR(WT)片段和含PHD2 3’UTR突變體(MUT)片段的質粒，再將其克隆至psiCHECK2，構建熒光素酶報告載體PHD2 3’UTR-WT和PHD2 3’UTR-MUT(WT-PHD2和MUT-PHD2)，分別與miR-424-5p模擬物、miR-NC共轉染至HC-OA，轉染24 h后收集細胞，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊操作，檢測熒光素酶活性。

1.5過表達miR-424-5p對HC-OA細胞凋亡、炎癥因子分泌及PHD2表達的影響HC-OA細胞按照每孔1×104個的密度接種于6孔板，使用不含胎牛血清的細胞培養液與miR-NC、miR-424-5p模擬物混合后室溫孵育5 min(A液)，Lipofectamine2000轉染試劑與不含胎牛血清的細胞培養液充分混合(B液)，A液與B液充分混勻后室溫孵育20 min，并將其加入HC-OA細胞，轉染6 h棄上清液后更換正常培養液，并繼續培養48 h，分別記為miR-NC組、miR-424-5p組。收集2組HC-OA細胞接種于24孔板(1×104個/孔)，加入500 μL Binding Buffer重懸，分別加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，室溫孵育10 min后應用流式細胞儀檢測細胞凋亡，計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

采用ELISA法檢測miR-NC組、miR-424-5p組HC-OA細胞培養液上清中炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-17的含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。實驗重復3次。同時檢測miR-424-5p及PHD2 mRNA和蛋白的表達，方法同前。

1.6過表達PHD2對HC-OA細胞中miR-424-5p表達、細胞凋亡及炎癥因子分泌的影響HC-OA細胞按照每孔1×104個的密度接種于6孔板，分為miR-424-5p組、miR-424-5p+pcDNA組和miR-424-5p+pcDNA-PHD2組，同上方法轉染處理。48 h后，同上檢測miR-424-5p表達、細胞凋亡及細胞培養液上清中炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-17的含量。

1.7統計學處理采用GraphPad Prism 7.0處理數據。采用兩獨立樣本t檢驗比較 HC和HC-OA中miR-424-5p及PHD2 mRNA和蛋白表達水平的差異，以及miR-NC組和miR-424-5p組miR-424-5p表達、細胞凋亡率、炎癥因子分泌水平及PHD2表達的差異，用單因素方差分析比較miR-424-5p組、miR-424-5p+pcDNA組和miR-424-5p+pcDNA-PHD2組miR-424-5p表達、細胞凋亡率及炎癥因子分泌水平的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1HC和HC-OA中miR-424-5p及PHD2mRNA和蛋白表達水平的比較與HC組相比，HC-OA組細胞中miR-424-5p 表達降低，PHD2 mRNA和蛋白的表達水平升高(P<0.05)，見圖1、表1。

表1 HC和HC-OA中miR-424-5p及PHD2 mRNA和蛋白表達的比較(n=3)

圖1 HC和HC-OA細胞中PHD2蛋白的表達

2.2miR-424-5p與PHD2靶向關系驗證生物信息學軟件預測顯示， miR-424-5p與PHD2的3’UTR存在9個互補的核苷酸序列，見圖2。轉染WT-PHD2和miR-424-5p模擬物的HC-OA細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，而轉染MUT-PHD2和miR-424-5p模擬物的HC-OA細胞熒光素酶活性無明顯變化。見表2。

圖2 miR-424-5p與PHD2的靶向結合位點

表2 miR-424-5p與PHD2靶向關系的驗證結果(n=3)

2.3過表達miR-424-5p對HC-OA細胞中miR-424-5p的表達、細胞凋亡、炎癥因子分泌水平及PHD2mRNA和蛋白表達的影響與miR-NC組相比，miR-424-5p組細胞中miR-424-5p表達升高，細胞凋亡率降低，IL-6、IL-1β、IL-17的分泌減少，PHD2 mRNA和蛋白的表達均降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 2組細胞中PHD2蛋白的表達

表3 過表達miR-424-5p對HC-OA細胞中miR-424-5p表達、細胞凋亡、炎癥因子分泌水平及PHD2表達的影響(n=3)

2.4過表達PHD2對HC-OA細胞中miR-424-5p表達、細胞凋亡及炎癥因子分泌的影響與miR-424-5p+pcDNA組相比，miR-424-5p+pcDNA-PHD2組細胞中miR-424-5p表達降低，細胞凋亡率升高，培養液上清中IL-6、IL-1β、IL-17的水平均升高(P<0.05)，見表4。

表4 過表達PHD2對對HC-OA細胞中miR-424-5p的表達、骨性關節炎軟骨細胞凋亡和炎癥因子分泌的影響(n=3)

3 討論

miRNA參與人類多種疾病的發生發展過程，其中包括骨性關節炎[6]。高杰等[7]報道，miR-424在骨髓間充質干細胞分化的骨細胞和軟骨細胞中的表達均升高，提示miR-424在骨髓間充質干細胞的更新和分化中具有重要作用。Xia等[8]發現，miR-424-5p在退化的軟骨間充質干細胞中的表達異常降低。Wang等[9]在膝關節骨性關節炎的研究中發現，miR-582-5p、miR-424-5p的表達均明顯降低，提示二者參與軟骨的硬化過程。基于以上研究，我們推測miR-424-5p在骨關節軟骨的分化及正常功能維持中具有重要作用，其對骨性關節炎軟骨細胞的存活可能具有一定的積極影響。本研究結果顯示，miR-424-5p在骨性關節炎軟骨細胞中的表達降低，與前文的研究結果一致。進一步研究發現，過表達miR-424-5p能夠抑制骨性關節炎軟骨細胞的凋亡和炎癥因子的分泌，提示miR-424-5p可抑制骨性關節炎軟骨細胞凋亡，并具有抗炎的作用。

本研究通過生物信息學分析、雙熒光素酶報告實驗驗證miR-424-5p可靶向負調控PHD2。研究[10]顯示HIF-1α信號通路在關節炎的發生、發展中發揮重要的促進作用，而PHDs是HIF-1α信號通路的關鍵調節因子之一。據報道[11]PHD2是調節HIF水平和關節炎細胞中血管生成基因表達的主要羥化酶，其通過HIF-α調節與關節炎相關的反應，且體外沉默PHD2能夠誘導關節炎患者血管生長因子的增加，減輕患者的病情。Cheng等[12]的研究顯示，PHD2是軟骨細胞分化的負調節因子，其通過調節HIF-1α信號傳導參與抑制關節軟骨祖細胞的分化。Lindsey等[13]發現，PHD2可介導軟骨細胞和成骨細胞基因中5-羥甲基胞嘧啶的增加，從而導致骨性關節炎和骨質疏松癥等衰弱性疾病。本研究結果顯示，PHD2在骨性關節炎軟骨細胞中的表達升高，與前人的研究結果相吻合。此外，本研究證實在骨性關節炎細胞中miR-424-5p可靶向負調控PHD2，而過表達PHD2能夠逆轉miR-424-5p在骨性關節炎軟骨細胞中的表達和抗凋亡、抗炎作用。這一結果揭示了miR-424-5p不僅可以靶向負調控PHD2，相反，PHD2也可以逆向反作用于miR-424-5p，從而發揮對關節炎軟骨細胞的調控功能，為miR-424-5p、PHD2在骨性關節炎中的診斷、治療提供了參考。當然，這一結果如果能在體內實驗得到驗證將更加充分和全面，這也將是本課題組下一步的研究計劃。

綜上所述，miR-424-5p可抑制骨性關節炎軟骨細胞的凋亡和炎癥反應，其機制可能與靶向PHD2有關，這一研究結果為骨性關節炎的治療提供了新方向。