miR-34a通過Wnt/β-catenin通路在氯胺酮致發育期大鼠海馬神經元凋亡中的作用

趙晨璐，趙以林，張 雪

1)駐馬店市中心醫院麻醉科 河南駐馬店 463000 2)華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院麻醉科 武漢 430032

研究[1]表明，常用的麻醉藥在人和動物中均會誘導海馬神經元變性和凋亡，從而導致學習和記憶障礙。氯胺酮是一種廣泛用于兒科麻醉的麻醉劑，主要通過阻斷N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受體發揮作用[2]。研究[3]表明，氯胺酮會導致新生SD大鼠海馬細胞凋亡，從而導致空間學習和記憶障礙。miRNA是一種小的非編碼RNA，通過與靶mRNA的3’非翻譯區(UTR)結合來調控基因的表達，在各種細胞進程中發揮著重要作用，如調節大腦發育(包括神經發生和成熟、皮質神經病變和神經退行性疾病)[4-6]。miR-34a在成年哺乳動物大腦中高度表達，并參與一系列神經發育和神經病理學進程[7]。研究[8]表明，miR-34a低表達可改善丙泊酚麻醉引起的神經毒性和認知功能障礙。已知miR-34a可能通過Wnt/β-catenin信號通路調節大鼠心肌梗死后的細胞凋亡[9]。本研究旨在觀察miR-34a對氯胺酮致發育期大鼠海馬神經元凋亡及Wnt/β-catenin通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料7 d齡雄性SD大鼠購自河北醫科大學實驗動物中心。HEK-293細胞購自美國典型培養物保藏中心。 鹽酸氯胺酮注射液購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；兔抗Bcl-2、Bax、Cyclin D1、β-catenin和GAPDH抗體購自Abcam公司，兔抗Wnt1抗體購自R&D Systems 公司，兔抗T細胞因子-4 (TCF-4)抗體購自Thermo Scientific公司；Neurobasal培養基購自南京森貝伽生物科技有限公司；miR-34a模擬物 (miR-34a)、miR-34a模擬物陰性對照 (miR-NC)、miR-34a抑制劑 (anti-miR-34a)、miR-34a 抑制劑陰性對照 (anti-miR-NC)、Wnt1 siRNA(si-Wnt1)、si-Wnt1陰性對照(si-NC)和anti-miR-NC、anti-miR-34a慢病毒均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa公司；熒光素酶報告基因試劑盒購自北京全式金公司；TUNEL檢測試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司；Lipofectamine2000購自Invitrogen公司。流式細胞儀購自美國BD公司；紫外分光光度計購自美國哈希公司。

1.2miR-34a和Wnt1靶向關系的預測和鑒定應用TargetScan靶基因預測軟件預測miR-34a與Wnt1基因的結合位點。采用雙熒光素酶報告實驗鑒定兩者的靶向關系：針對Wnt1 3’UTR端序列構建野生型(WT)和突變型(MUT)報告基因質粒。將Wnt1的WT和MUT載體分別與miR-NC、miR-34a共轉染至HEK-293細胞，48 h后檢測熒光素酶活性。

1.3氯胺酮對發育期海馬神經元miR-34a表達、凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響取7 d齡雄性SD大鼠海馬組織，胰蛋白酶消化獲得單個細胞。Neurobasal培養基將細胞重懸，按2×106個/mL接種至培養皿，37 ℃、體積分數5%CO2條件下培養，每3 d更換一半培養液。3 d后，將5 mg/L阿糖胞苷C添加至培養皿內孵育24 h，防止神經膠質細胞增殖。向海馬神經元中加入氯胺酮(終濃度為0.2 mg/L)[10]，37 ℃、體積分數5%CO2條件下孵育24 h，以未處理的海馬神經元為空白對照。

收集2組細胞，Trizol法提取總RNA，反轉錄獲得cDNA。miR-34a上游引物5’-GGTCACAAGAC CCTCACCTG-3’， 下游引物5’-TCACAGCAGAC CCTTGATGT-3’。內參U6上游引物5’-CTCGCT TCGGCAGCACATATACT-3’，下游引物5’-ACGCT TCACGAATTTGCGTGTC-3’。反應體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×) 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，dH2O 8.5 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-34a的相對表達水平。實驗重復3次。

收集2組細胞，預冷PBS洗滌后，加500 μL 結合緩沖液重懸，先后加入Annexin V-FITC和PI各10 μL，分別室溫避光孵育10 min，隨后上流式細胞儀檢測細胞凋亡，計算凋亡率。實驗重復3次。

收集2組細胞，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE，濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上。100 g/L脫脂奶粉室溫封閉3 h，加入一抗(Bcl-2抗體按1∶1 000稀釋，Bax抗體按1∶2 000稀釋)，4 ℃過夜孵育。以辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h后，ECL發光、曝光。Image J分析條帶灰度值，以目的條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.4上調或抑制miR-34a的表達對氯胺酮處理的發育期海馬神經元中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的影響7 d齡雄性SD大鼠海馬神經元以4×105個/孔接種于6孔板，以終濃度為0.2 mg/L的氯胺酮處理24 h 后分為4組。miR-NC組、miR-34a組、anti-miR-NC組和anti-miR-34a組分別給予終濃度為50 nmol/L的miR-NC、miR-34a、anti-miR-NC和anti-miR-34a，并和Lipofectamine2000室溫孵育20 min，隨后37 ℃、體積分數5%CO2條件下培養48 h。提取4組細胞總蛋白，同上檢測和分析Wnt/β-catenin通路相關蛋白的表達(Wnt1和β-catenin抗體按1∶1 000稀釋，TCF-4和Cyclin D1抗體按1∶2 000稀釋)。實驗重復3次。

1.5抑制miR-34a及Wnt1的表達對氯胺酮誘導的SD大鼠空間學習能力、海馬組織中miR-34a的表達及細胞凋亡的影響

1.5.1 大鼠分組與處理 7 d齡SD大鼠于安靜、舒適條件下飼養，由母鼠喂養。1周后，將SD大鼠隨機分為5組：空白對照組、氯胺酮組、anti-miR-NC+si-NC組、 anti-miR-34a+si-NC組 和anti-miR-34a+si-Wnt1組，每組6只。空白對照組大鼠腹腔和左側大腦側腦室海馬注射生理鹽水,其余4組大鼠除腹腔注射80 mg/kg氯胺酮[11]外，分別于大腦左側側腦室海馬注射4 μL生理鹽水、2 μL anti-miR-NC和2 μL si-NC慢病毒液、2 μL anti-miR-34a和2 μL si-NC慢病毒液、2 μL anti-miR-34a和2 μL si-Wnt1慢病毒液，1次/d，連續3 d。操作結束后，將大鼠放入暖箱并保持低流量氧氣輸送，直至蘇醒。大鼠與母鼠的分離時間均為250 min[12]。

1.5.2 5組大鼠空間學習能力檢測 末次給藥24 h后，5組大鼠各取3只，養至2個月大時，進行Morris水迷宮實驗。實驗裝置由圓形水池(直徑200 cm，高60 cm)和平臺組成，水溫(25.0±1.0) °C。將大鼠面向池壁放入池中，讓其自由尋覓平臺，并在平臺上休息30 s，如120 s內未找到平臺則將其手動放至平臺休息30 s。每天訓練1次，連續訓練5 d。訓練結束后，測試大鼠從下水至第1次找到平臺的時間，即逃避潛伏期。

1.5.3 5組大鼠海馬組織中miR-34a表達水平及細胞凋亡檢測 末次給藥24 h后，每組取3只大鼠，腹腔注射戊巴比妥那(80 mg/kg)麻醉后處死，收集新鮮海馬組織，-80 ℃條件下保存。采用qRT-PCR法測定海馬組織中miR-34a的表達，方法同上。實驗重復3次。

以40 g/L多聚甲醛固定大鼠海馬組織，石蠟包埋后切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。采用TUNEL試劑盒檢測神經元凋亡。

1.6統計學處理采用SPSS 21.0處理數據。采用兩獨立樣本t檢驗比較miR-NC、miR-34a組熒光素酶活性以及空白對照組與氯胺酮組海馬神經元miR-34a表達、細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達的差異；采用單因素方差分析比較4組海馬神經元Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的差異以及5組大鼠逃避潛伏期、海馬組織miR-34a的表達和細胞凋亡率的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1miR-34a與Wnt1基因靶向關系的預測和驗證預測的miR-34a與Wnt1 3’UTR結合位點見圖1。雙熒光素酶報告實驗結果見表1。miR-34a與Wnt1-WT報告基因共轉染的細胞熒光素酶活性降低，而與Wnt1-MUT共轉染的細胞的熒光素酶活性無明顯變化。

圖1 miR-34a與Wnt1 3’UTR結合位點

表1 雙熒光素酶報告實驗結果

2.2氯胺酮對海馬神經元中miR-34a表達、凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響結果見圖2和表2。與空白對照組相比，海馬神經元經氯胺酮處理后，miR-34a表達、細胞凋亡率和Bax蛋白表達均升高，Bcl-2蛋白表達降低。

圖2 2組海馬神經元中Bax、Bcl-2蛋白的表達

表2 2組海馬神經元中miR-34a表達、細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達的比較

2.3上調或抑制miR-34a的表達對氯胺酮處理的海馬神經元中Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的影響結果見圖3和表3。與miR-NC組相比，miR-34a組Wnt1、TCF-4、Cyclin D1和β-catenin蛋白表達均降低；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-34a組上述蛋白的表達均升高。

圖3 4組海馬神經元中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達

表3 4組海馬神經元Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的比較

'2.4抑制miR-34a及Wnt1的表達對氯胺酮誘導的SD大鼠空間學習能力、海馬組織中miR-34a的表達和細胞凋亡的影響結果見圖4、表4。與空白對照組相比，氯胺酮組大鼠逃避潛伏期延長，海馬組織中miR-34a表達和細胞凋亡率升高；與anti-miR-NC+si-NC組相比，anti-miR-34a+si-NC組大鼠逃避潛伏期縮短，海馬組織中miR-34a表達和細胞凋亡率降低；與anti-miR-34a+si-NC組相比，anti-miR-34a+si-Wnt1組大鼠逃避潛伏期延長，海馬組織中細胞凋亡率升高。

圖4 5組大鼠海馬組織TUNEL染色結果(×400)

表4 5組SD大鼠逃避潛伏期、海馬組織miR-34a的表達和細胞凋亡率的比較

3 討論

氯胺酮是一種在臨床實踐中被廣泛使用的麻醉劑。研究[12-13]表明，氯胺酮可以促進人和動物大腦發育中的神經元死亡；使用氯胺酮麻醉懷孕大鼠可能會促進胎兒海馬的自噬和細胞凋亡。有研究[14]顯示，包括miR-34a在內的40多種miRNA在麻醉劑(七氟醚、異氟烷、異丙酚和氯胺酮)誘導的神經毒性中具有調節作用。此外，miR-34a基因沉默可通過調節Notch信號通路抑制神經元凋亡，改善癲癇小鼠的空間認知能力并保護海馬神經[15-16]。本研究結果表明，氯胺酮處理會誘導發育期SD大鼠海馬神經元中miR-34a表達和細胞凋亡率升高，并導致大鼠空間學習能力障礙；下調miR-34a的表達則會抑制氯胺酮致發育期大鼠海馬組織中的細胞凋亡并改善其空間學習能力。

Wnt/β-catenin信號通路在多細胞真核生物中高度保守，與細胞凋亡、中性干細胞模式化以及不同細胞類型中的細胞增殖和分化密切相關[17]。Wnt/β-catenin信號通路的激活與神經保護作用密切相關[18]。Wnt1是Wnt/β-Catenin信號通路的關鍵分子。有研究[9]表明，miR-34a靶向Wnt1通過Wnt/β-catenin信號通路調節大鼠心肌梗死后的細胞凋亡。本研究通過生物信息學分析預測軟件和雙熒光素酶報告實驗證明Wnt1與miR-34a存在靶向關系。體內外實驗證明，氯胺酮處理會升高發育期大鼠海馬神經元中miR-34a的表達，促進細胞凋亡及凋亡相關因子Bax蛋白的表達，抑制Bcl-2蛋白的表達；上調miR-34a的表達可抑制經氯胺酮處理的海馬神經元中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達，下調miR-34a的表達則可上調該信號通路相關蛋白的表達；氯胺酮處理會升高發育期SD大鼠海馬組織中miR-34a表達，促進細胞凋亡，導致其空間學習能力障礙，下調miR-34a的表達可抑制氯胺酮致大鼠海馬組織中細胞凋亡并改善其空間學習能力，低表達Wnt1則可減弱上述改善作用，提示調低miR-34a可能通過Wnt1促進經氯胺酮處理的發育期SD大鼠海馬神經元中Wnt/β-catenin信號通路激活，抑制海馬神經元凋亡。

綜上所述，miR-34a可促進氯胺酮致發育期大鼠海馬神經元凋亡，其機制可能與靶向Wnt1調節Wnt/β-catenin通路有關。后續將進一步探討miR-34a對氯胺酮導致的發育期大鼠其他生物學特性的影響。