利拉魯肽對失重大鼠骨質疏松及骨髓間充質干細胞成骨細胞分化的影響

薛 瑩，王 雨，司方瑩，喬高星，鄧詩萌，杜書章

1)鄭州大學第一附屬醫院藥學部 鄭州 450052 2)解放軍94750部隊醫院藥房 福建龍巖 366200

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1) 是由腸道L細胞分泌的一種具有30個氨基酸的多肽類激素，其可以通過激活胞膜上的GLP-1受體發揮調節葡萄糖穩態的作用[1-2]。臨床上通常將GLP-1用于治療2型糖尿病，亦有報道[2]顯示GLP-1同時具有神經和心血管保護及促進骨形成的作用，但GLP-1作為多肽類物質易被二肽基肽酶Ⅳ快速降解，半衰期僅有2 min左右，進而導致其臨床應用受到一定限制。利拉魯肽(liraglutide，LIRA)是GLP-1受體激動劑，具有較長的半衰期且穩定性較高，其除可以血糖濃度依賴性調整血糖外,還具有減重及保護心血管等作用，在臨床和科研中獲得廣泛關注[3-5]。有研究[6]報道，GLP-1類似物Exendin-4可以通過激活GLP-1受體調控骨髓間充質干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細胞分化，抑制向脂肪細胞分化，從而促進骨形成和骨修復。同樣有研究[7-8]證實，LIRA可改善血糖異常導致的骨量丟失，亦可對抗糖皮質激素性骨質疏松，但LIRA對失重導致的骨量丟失是否能發揮同樣的骨保護作用尚不清楚。因此，本研究擬以失重大鼠為研究對象，探究LIRA對失重性骨質疏松的改善作用。另有研究[9-10]顯示，尾懸吊大鼠BMSCs體外誘導培養后仍能表現出在體時失重刺激導致的分化方向和能力的改變，保持機體對外界刺激反應的延續性，因此，本研究擬進一步提取失重大鼠BMSCs體外培養，并予以LIRA刺激，以觀察其對BMSCs的成骨分化及礦化能力的影響，從而進一步闡明LIRA改善失重性骨質疏松的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組SPF級12周齡SD雄性大鼠30只(購自鄭州大學實驗動物中心)，應用隨機數字表分為對照組、失重組、失重+LIRA組，每組10只。對照組大鼠正常狀態自由活動，失重組及失重+LIRA組大鼠采用尾懸吊(共懸吊28 d)的方法構建失重模型，失重+LIRA組大鼠于尾懸吊2 d后開始腹腔注射LIRA 200 μg/(kg·d)，1次/d，每周連續6 d，連續給藥4周。

1.2Micro-CT檢測大鼠骨形成于失重+LIRA組大鼠最后一次給藥1 d后，以20 g/L戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，放置于Micro-CT儀中掃描股骨。像素10 μm。通過儀器檢測骨體積分數(bone volume/tissue volume, BV/TV)，骨小梁數量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)和骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)等指標。分析軟件為Inveon Research Workplace 2.2, SIEMENS Healthineers。

1.3實驗試劑LIRA(P5499)購自Sigma公司，α-MEM購自HyClone公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，CD29(ab36219)、Sca-1(ab268016)、CD34(ab81289)、CD45(ab25386)、Runx-2(ab23981)和Osterix(ab209484) 抗體均購自Abcam公司，qRT-PCR 試劑盒購自TaKaRa公司，Trizol購自Invitrogen公司，BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術公司，Western blot化學發光法檢測試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.4大鼠BMSCs的分離、培養及鑒定取1.1中對照組及失重組大鼠，Micro-CT檢測完成后，采用頸椎脫臼法處死，體積分數75%乙醇浸泡15 min，轉移至無菌操作臺，眼科剪剪開股骨以及脛骨皮毛，鈍性分離肌肉等組織，將小鼠股骨和脛骨取出，刮凈附著的肌肉及血管。骨兩端剪開，用PBS沖洗骨髓腔，將沖洗液進行離心，裂紅，再離心，用含血清的培養基重懸細胞，接種在細胞培養瓶中，于37 ℃、體積分數5% CO2孵箱中培養，每3 d換液1次。將分離獲得的細胞傳至第2代，PBS清洗3次，2.5 g/L胰蛋白酶消化2～3 min，加入培養基(含FBS)終止消化，轉移至15 mL離心管中，300×g離心 5 min，重懸，分別轉移至2個離心管，加入熒光偶聯抗體(CD29/Sca-1/CD34/CD45)，4 ℃孵育過夜，于流式細胞儀檢測熒光強度。以下細胞實驗每組細胞均設3個復孔且重復3次。

1.5大鼠BMSCs成骨分化的誘導培養及鑒定取對照組及失重組第2代BMSCs，按照2×105個/孔接種在6孔板中，貼壁后給予LIRA (1、10 或100 nmol/L)共孵育，每3 d換液1次，培養21 d，通過茜素紅染色鑒定BMSCs的多向分化及礦化情況。

1.6qRT-PCR檢測Runx-2、Osterix mRNA表達取對照組及失重組第2代BMSCs，按照2×105個/孔接種在6孔板中，貼壁后給予LIRA(1、10 或100 nmol/L)共孵育，每3 d換液1次，培養15 d，棄細胞上清液，PBS洗3次。加入1 mL Trizol裂解細胞，隨后加入0.2 mL氯仿，上下顛倒混勻，12 000×g離心10 min，提取上清液，加入等量異丙醇，上下顛倒，靜置15 min，12 000×g離心10 min，去除上清，加入1 mL 75%乙醇，清洗，12 000×g離心10 min，去除上清，沉淀即為總RNA，加入30 μL RNase free水溶解，-80 ℃保存。檢測總RNA濃度，反轉錄得cDNA，反轉錄步驟按照試劑盒說明操作。以cDNA為模板，進行qRT-PCR。PCR擴增條件： 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 40 s，循環數為30次；最后72 ℃ 5 min延伸。GAPDH為內參基因，采用2-ΔΔCt計算待測mRNA表達水平。相關引物序列見表1。

表1 Runx-2、Osterix及GAPDH引物序列

1.7Western blot檢測Runx-2、Osterix蛋白表達取對照組及失重組第2代BMSCs，按照2×105個/孔接種在6孔板中，貼壁后給予LIRA (1、10 或100 nmol/L)共孵育，每3 d換液1次，培養15 d，棄細胞上清液，PBS洗3次。加入RIPA裂解液(含有PMSF和磷酸酶抑制劑)，冰上孵育20 min，收集裂解液，12 000×g離心15 min，提取上清，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。配制電泳緩沖液，上樣，電壓為80 V/120 V；轉膜條件為100 V 100 min。PVDF膜甲醇浸泡10 s，去離子水浸泡5 min，轉膜緩沖液浸泡5 min，轉膜夾板采用三明治方法，將膠和膜夾在中間，兩側分別為人造棉和濾紙；轉膜結束，膜浸泡在麗春紅中室溫染色2 min，清洗，觀察紅色條帶位置以及預估目的條帶位置。剪下目的條帶，脫脂牛奶室溫封閉2 h，清水洗凈，4 ℃一抗(Runx-2、Osterix和GAPDH抗體均按1∶1 000稀釋)封閉過夜，PBST洗10 min×3次；室溫下二抗(按1∶5 000稀釋)孵育2 h，PBST洗10 min×3次；按照發光試劑盒使用說明于化學發光儀上檢測蛋白表達水平。

1.8統計學處理采用SPSS 17.0進行數據分析，應用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較3組大鼠股骨相關參數的差異，應用2×3析因設計的方差分析比較對照組和失重組細胞中Runx-2、Osterix mRNA和蛋白表達的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1各組大鼠股骨相關參數的比較Micro-CT結果見圖1、表1。失重組BV/TV、Tb.N、Tb.Th低于對照組，而Tb.Sp高于對照組。失重+LIRA組大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th較失重組增加，Tb.Sp降低；與對照組相比，差異無統計學意義；說明LIRA可以改善失重導致的骨量丟失。

圖1 各組大鼠股骨Micro-CT 掃描圖

表1 各組大鼠Micro-CT 掃描股骨相關參數比較(n=10)

2.2BMSCs的鑒定本研究選用BMSCs表面特異性標志物Sca-1、CD29、CD34及CD45標記BMSCs，BMSCs高表達Sca-1、CD29，不表達或低表達CD34、CD45。結果顯示，分離的細胞中高表達Sca-1和CD29的細胞總細胞數的95.5%，表達CD34、CD45的細胞占0.4%，證明本實驗獲得較純的BMSCs。

2.32組BMSCs成骨分化的比較茜素紅染色結果顯示，與對照組相比，失重組礦化結節的數量減少；隨著LIRA濃度的提高，2組BMSCs礦化結節形成數量增多(圖2)。隨著LIRA濃度的提高，2組BMSCs中Runx-2和Osterix mRNA和蛋白的表達升高；而與對照組相比，失重組mRNA及蛋白表達量降低(圖3、表2和表3)。結果表明失重可抑制BMSCs向成骨細胞分化，而LIRA能夠改善失重導致的成骨分化抑制狀態，同時對照組的結果也提示LIRA對正常組大鼠具有預防骨丟失的作用。

圖2 2組BMSCs成骨分化的觀察(茜素紅染色，×100)

圖3 各組細胞中Runx-2及Osterix 蛋白的表達

表2 各組細胞中Runx-2 mRNA及Osterix mRNA 表達水平的比較(n=3)

表3 各組細胞中Runx-2及Osterix 蛋白表達水平的比較(n=3)

3 討論

骨質疏松癥具有骨量減少、骨微結構破壞、骨脆性增加、骨折危險性上升的特征，其分類及形成因素復雜：例如老年性骨質疏松，是由于成骨細胞分化能力降低，而破骨細胞骨吸收能力提高，從而導致骨吸收強于骨形成，最終形成骨質疏松；絕經性骨質疏松則是成骨細胞和破骨細胞活性均提高，但破骨細胞活性提高強于成骨細胞，從而導致骨質丟失，最終形成骨質疏松[11]。失重導致的骨質疏松則集中出現在宇航員中，嚴重威脅宇航員的身體健康和任務完成度。因此，研究失重性骨代謝紊亂成為近些年的研究熱點。

Morey-Holton等[12]提出的尾部懸吊后肢卸荷大鼠模型以及Falcai等[13]提出的尾部懸吊后肢自由懸垂不負重狀態模型都是目前最常用的模擬失重大鼠模型。研究[14-18]表明，尾部懸吊模型能夠很好地模擬空間飛行失重狀態，其股骨和脛骨的骨量降低，骨小梁數量降低，厚度減少，因此此模型被廣泛應用于失重研究。

LIRA作為GLP-1受體激動劑，可以與細胞GLP-1受體結合，促進胰島素分泌[19]。研究[2]證實，LIRA與艾塞那肽類似，均由小腸L細胞分泌，具有降低食欲，抑制胃排空，提高飽腹感的特點。有研究[20]證實，小鼠敲除GLP-1受體后，骨量、骨小梁厚度以及數量明顯降低，表明GLP-1受體在骨形成中發揮著重要作用。與此同時，有研究[21]報道，分別給予卵巢切除小鼠LIRA和艾塞那肽治療，能夠顯著提高骨量，增加骨小梁數量和厚度，降低骨小梁間隙，且LIRA的效果更佳。本研究動物實驗發現失重能夠導致大鼠骨量丟失，而LIRA可以緩解失重造成的骨量丟失，提高骨形成能力；細胞實驗發現失重能夠抑制BMSCs向成骨細胞分化，而LIRA可以促進BMSCs向成骨細胞分化且該促進作用與LIRA濃度呈正相關。此結果與溫濱紅等[22]在糖尿病并發卵巢切除誘導的骨質疏松大鼠中的研究結果相似，同時本研究亦提示LIRA對于正常大鼠具有預防骨丟失作用。

綜上，LIRA可以作為抗骨質疏松的藥物，這為臨床的骨質疏松以及骨折等治療提供了一個解決方法。但LIRA促進BMSCs成骨分化的機制，LIRA相比其他的GLP-1受體激動劑在促進骨形成中具有何種優勢和劣勢尚不清楚。由于本文的關注點在于LIRA對于失重導致的骨丟失的緩解作用，且目前對GLP-1受體激動劑的研究主要集中在治療領域，因此對于LIRA對正常大鼠骨丟失的預防作用以及相關副作用有待進一步研究。