結(jié)直腸癌組織中KRAS、NRAS及BRAF基因突變狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

孫耀華，汪潤秋，趙 靜，李雪瑩，楊慧玲，白辰光

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 上海 200433

結(jié)直腸癌是常見的嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤[1]。在我國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤的第三位和第五位[2]，且其發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)[3]。盡管手術(shù)方式、放化療方案、以及靶向治療藥物得到了不斷改進(jìn)，但晚期結(jié)直腸癌的預(yù)后仍不樂觀。

KRAS、NRAS、BRAF基因是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)依賴的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路RAS-RAF-MAPK中的3個(gè)重要基因，這些基因突變后會(huì)導(dǎo)致下游信號(hào)通路的持續(xù)激活，引起細(xì)胞發(fā)生不依賴于表皮生長因子刺激的異常增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和持續(xù)進(jìn)展。2018年版《結(jié)直腸癌分子生物標(biāo)志物檢測專家共識(shí)》[4]推薦，對(duì)臨床確診的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，應(yīng)進(jìn)行RAS(包括KRAS和NRAS)和BRAF基因檢測，以對(duì)預(yù)后進(jìn)行分層，指導(dǎo)臨床治療。雖然國內(nèi)有一些關(guān)于KRAS、NRAS和BRAF基因在結(jié)直腸癌組織中突變情況的報(bào)道，但是由于樣本量的限制和病例篩選的差異，研究結(jié)果有所不同，特別是來自單中心大樣本的病例研究較少。本研究采用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)檢測了單中心1 205例結(jié)直腸癌根治患者癌組織中KRAS、NRAS、BRAF基因的突變狀態(tài)，探討其與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1臨床資料收集海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年5月至2016年4月共計(jì)1 205例資料完整、病理診斷明確的結(jié)直腸癌標(biāo)本。研究通過該院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。1 205例結(jié)直腸癌患者年齡15～88歲，<40歲88例，40～歲663例，≥60歲454例；男722例，女483例，男女比為1.49:1。原發(fā)部位為右半結(jié)腸244例，左半結(jié)腸300例，直腸661例；1 029例診斷為普通型腺癌，176例為黏液腺癌；132例為低分化腺癌，1 073例為高/中分化腺癌；腫瘤最大徑<4 cm者498例，≥4 cm者707例；510例檢出區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；pTNM分期Ⅰ期212例，Ⅱ期439例，Ⅲ/Ⅳ期554例。

1.2結(jié)直腸癌組織中KRAS、NRAS、BRAF基因突變檢測

1.2.1 標(biāo)本處理 所有標(biāo)本離體后立即用中性福爾馬林溶液固定，規(guī)范取材后，于全自動(dòng)脫水機(jī)(LEICA ASP300S)中梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚切片，HE染色。由兩位病理醫(yī)師閱片，標(biāo)識(shí)出腫瘤豐富的區(qū)域(區(qū)域內(nèi)腫瘤細(xì)胞比例>40%，且保證含有200～400個(gè)腫瘤細(xì)胞)。盡量選取以腫瘤細(xì)胞為主，沒有明顯壞死、黏液和炎性改變的組織進(jìn)行基因檢測，以提高檢測的準(zhǔn)確性。

1.2.2 DNA提取 將經(jīng)過病理醫(yī)師標(biāo)識(shí)的蠟塊10 μm連續(xù)切片5張并黏附于載玻片上，烤片后經(jīng)梯度乙醇脫蠟至水，小心轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。DNA提取嚴(yán)格按照廈門艾德生物有限公司的說明書操作，用紫外分光光度計(jì)(美林恒通SMA4000)測量所提DNA的質(zhì)量和純度。

1.2.3 基因突變檢測 采用ARMS和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，應(yīng)用廈門艾德生物有限公司生產(chǎn)的人類KRAS/NRAS/BRAF基因突變聯(lián)合檢測試劑盒(貨號(hào)ADx-KN04-MX)，檢測標(biāo)本DNA中KRAS基因第 2、3、4 號(hào)外顯子，NRAS基因第2和第3號(hào)外顯子，BRAF基因第15號(hào)外顯子的熱點(diǎn)突變。試劑盒可檢測位點(diǎn)見表1。標(biāo)本 DNA的稀釋、配置、加樣、反應(yīng)循環(huán)參數(shù)及結(jié)果判讀均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。每次反應(yīng)均設(shè)定各種突變的陽性及陰性對(duì)照。PCR儀為美國Stratagene公司的Mx3000P。

表1 KRAS/NRAS/BRAF基因突變聯(lián)合檢測試劑盒可檢測位點(diǎn)

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用χ2檢驗(yàn)或精確概率法比較不同臨床病理特征的結(jié)直腸癌組織中KRAS、NRAS、BRAF基因突變狀態(tài)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌組織中KRAS、NRAS、BRAF基因的突變狀態(tài)1 205例中，KRAS基因突變檢出率為44.6%(538/1 205)，其中95.9%(516/538)為第2外顯子第12、13密碼子突變。NRAS基因突變檢出率為2.7%(33/1 205)，其中93.9%(31/33)為第2外顯子第12、13密碼子突變。BRAF基因突變檢出率為3.2%(38/1 205)，均為V600E。未發(fā)現(xiàn)KRAS、NRAS、BRAF基因之間存在有交叉突變。

2.2結(jié)直腸癌組織中KRAS、NRAS、BRAF基因的突變狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系見表2。①KRAS：黏液腺癌組織中KRAS基因突變檢出率明顯高于普通型腺癌；高/中分化癌組織中檢出率高于低分化癌組織;女性患者檢出率高于男性;原發(fā)于右半結(jié)腸的癌組織中KRAS基因突變檢出率略高于原發(fā)于直腸的癌組織，原發(fā)于左半結(jié)腸的癌組織中檢出率最低(P<0.05)。②NRAS：不同性別、年齡、原發(fā)部位、組織學(xué)類型、分化程度、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)和pTNM分期的癌組織中KRAS基因突變檢出率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在<40歲的患者中未檢出NRAS基因突變。③BRAF：原發(fā)于右半結(jié)腸、黏液腺癌、低分化、腫瘤最大徑≥4 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期Ⅲ/Ⅳ期的癌組織中BRAF基因突變檢出率明顯更高(P<0.05)。

表2 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌組織中KRAS、NRAS及BRAF基因突變分析

3 討論

2018年版《結(jié)直腸癌分子生物標(biāo)志物檢測專家共識(shí)》[4]推薦:對(duì)臨床確診為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，應(yīng)進(jìn)行KRAS、NRAS和BRAF基因檢測;RAS基因突變分析應(yīng)包括KRAS和NRAS基因2號(hào)外顯子、3號(hào)外顯子以及4號(hào)外顯子;BRAF V600E基因狀態(tài)的評(píng)估應(yīng)在RAS檢測時(shí)同步進(jìn)行。

相關(guān)研究[5]結(jié)果顯示，KRAS基因在結(jié)直腸癌患者中的突變率為20%～50%。本研究中結(jié)直腸癌組織中KRAS基因突變檢出率為44.6%(538/1 205)，與文獻(xiàn)報(bào)道相近；黏液腺癌組織中KRAS基因突變檢出率高于普通型腺癌，高/中分化癌組織中檢出率高于低分化癌組織，提示KRAS基因突變可能與結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展有關(guān)。有文獻(xiàn)[6]報(bào)道，KRAS基因突變與結(jié)直腸癌pTNM分期關(guān)系密切；但本研究中未發(fā)現(xiàn)該突變與pTNM分期有關(guān)，也有一些報(bào)道[7-8]與本研究結(jié)果相似。我們認(rèn)為，在許多結(jié)直腸腺瘤組織中也可檢出KRAS基因突變，說明KRAS基因突變?cè)谀[瘤發(fā)生的早期就已出現(xiàn)，其與反映腫瘤進(jìn)展的pTNM分期的關(guān)系還不明確。本研究結(jié)果還顯示女性患者KRAS基因突變檢出率高于男性，劉珊等[9]的研究結(jié)果也有類似發(fā)現(xiàn)，但多數(shù)研究認(rèn)為KRAS基因突變與性別無關(guān)。

NRAS基因是RAS基因家族中的一員， 其突變狀態(tài)對(duì)于結(jié)直腸癌靶向藥物的治療效果具有重要意義。本研究中，結(jié)直腸癌組織中NRAS基因突變檢出率為2.7%(33/1 205)，與de Roock等[10]結(jié)果近似。本研究未發(fā)現(xiàn)NRAS基因突變與結(jié)直腸癌的臨床病理特征有關(guān)，但40歲以下的患者中未檢出NRAS突變，檢出NRAS突變的病例最小年齡是46歲；原發(fā)于直腸的癌組織中NRAS基因突變檢出率較高。我們推測患者年齡、原發(fā)部位可能與NRAS基因突變有一定關(guān)聯(lián)，有待擴(kuò)大病例數(shù)進(jìn)一步分析證實(shí)。

BRAF基因編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，參與調(diào)控如細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，該基因突變狀態(tài)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及臨床預(yù)后有關(guān)。BRAF基因與RAS基因雖然同處于RAS-RAF-MAPK通路，但它們相互排斥，即如果腫瘤存在RAS基因突變，那么就不會(huì)同時(shí)發(fā)生BRAF基因突變，反之亦然，但這并不意味著BRAF和RAS檢測只需選擇其中之一。有研究[4]發(fā)現(xiàn)EGFR單抗(西妥昔單抗和帕尼單抗)對(duì)存在BRAF基因V600E突變的患者治療無效，所以建議BRAF V600E基因狀態(tài)的評(píng)估應(yīng)在RAS檢測時(shí)同步進(jìn)行，以指導(dǎo)臨床進(jìn)行個(gè)體化的精準(zhǔn)治療。本研究中，結(jié)直腸癌組織中BRAF突變檢出率僅為3.2%(38/1 205)，略低于國內(nèi)外的報(bào)道(4%～10%)[11-13]，可能與本組病例中原發(fā)部位為直腸和左半結(jié)腸的患者比例較高(接近80%)有關(guān)。BRAF基因突變與多種不良預(yù)后相關(guān)臨床病理特征關(guān)系密切。在原發(fā)部位方面，右半結(jié)腸癌組織中BRAF突變檢出率達(dá)6.1%(15/244)，與Chen等[14]的結(jié)果相似；在組織學(xué)類型方面，黏液腺癌BRAF突變檢出率達(dá)6.3%(11/176)，高于普通型腺癌；在分化程度方面，低分化癌BRAF突變檢出率達(dá)9.8%(13/132)，明顯高于高/中分化癌；腫瘤最大徑≥4 cm和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中BRAF突變檢出率也明顯較高；腫瘤pTNM分期方面，Ⅰ期癌組織中BRAF突變檢出率僅為0.9%，Ⅱ期上升為2.3%，Ⅲ/Ⅳ期癌組織中檢出率上升至4.7%，提示存在BRAF基因突變的結(jié)直腸癌進(jìn)展較快，與臨床所見一致。既往研究[15]也顯示，BRAF基因突變的結(jié)直腸癌患者5 a生存率明顯降低。

綜上，本研究結(jié)果提示，KRAS基因突變與結(jié)直腸癌組織學(xué)類型和分化程度有一定相關(guān)性，而BRAF基因突變與結(jié)直腸癌諸多不良預(yù)后相關(guān)臨床病理特征關(guān)系密切。對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行準(zhǔn)確的基因分析有助于臨床開展個(gè)體化的精準(zhǔn)治療，提升患者預(yù)后和生活質(zhì)量。本研究整理了單中心1 205例結(jié)直腸癌根治標(biāo)本的詳細(xì)檢測數(shù)據(jù)，提供了寶貴的循證醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)，我們進(jìn)一步將完善隨訪數(shù)據(jù)，進(jìn)行更深入的探討。