基因組拷貝數(shù)變異測序聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列分型在孕早期自然流產(chǎn)病因分析中的應(yīng)用

張 倩, 吳 東, 肖 海, 李新蕊, 崔 彬, 張夢汀, 張曉梅,侯巧芳, 廖世秀

1)河南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳研究所 鄭州 450003 2)河南省遺傳性疾病功能基因組重點實驗室 鄭州 450003 3)鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 鄭州 450003

自然流產(chǎn)(spontaneous abortion，SA)是導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的最常見原因之一，一般認為在28個完整孕周內(nèi)發(fā)生的非個人意愿終止妊娠均屬于SA[1]。SA增加孕婦再次流產(chǎn)的風(fēng)險[2]，并且導(dǎo)致多種心理問題，給女性的身心帶來巨大傷害的同時，還給家庭增添了較多經(jīng)濟和心理負擔(dān)。孕早期SA是發(fā)生在孕12周以前(孕早期)的自發(fā)性流產(chǎn)。引起SA的因素較多，包括遺傳物質(zhì)改變、感染、化學(xué)毒性暴露、免疫功能障礙、內(nèi)分泌失調(diào)、產(chǎn)婦疾病和不健康的生活方式等[2-3]。文獻[4]報道，將近一半的SA尤其是孕早期SA往往由染色體異常引起。因此孕早期遺傳物質(zhì)檢測在查明SA原因以及指導(dǎo)再次妊娠等方面具有重要意義。拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing，CNV-Seq)是基于高通量測序平臺的檢測技術(shù)，具有覆蓋范圍廣、通量高、操作簡便等優(yōu)點，且樣本DNA用量少[5]，現(xiàn)逐漸被國內(nèi)外很多實驗室推廣使用，其技術(shù)也可用于流產(chǎn)組織的遺傳物質(zhì)分析[6]。課題組選取了545例孕早期SA胚胎組織樣本，使用CNV-Seq技術(shù)對其進行全基因組拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)分析；同時為排除母體污染，對所有樣本進行短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)分型檢測，并對一些特殊結(jié)果用其他平臺進行驗證，以探討CNV-Seq及STR分型聯(lián)合應(yīng)用在孕早期SA原因分析上的可行性，現(xiàn)具體報道如下。

1 資料與方法

1.1研究樣本2019年1月至2020年3月收集到河南省人民醫(yī)院遺傳研究所就診的孕12周前發(fā)生SA患者的胚胎組織。取標(biāo)本時同時采集了組織樣本父母的外周血用以母體排污以及其他協(xié)助診斷，本研究所用的標(biāo)本均獲得孕婦及其家屬的知情同意。

1.2樣本的處理、DNA提取和純化在無菌條件下，將收集到的胚胎組織進行解剖，從絨毛膜絨毛區(qū)域中仔細挑選可用的絨毛組織，取綠豆大小樣本，用磷酸鹽緩沖液徹底清洗3次，以最大限度地減少母體細胞污染。于-20 ℃冰箱中保存。使用DP304-03基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)進行DNA提取。使用Genomic DNA Clean & ConcentratorTM純化濃縮試劑盒(ZYMO)對通過質(zhì)控的DNA進行純化。純化后進行Qubit定量，Clean_Q30≥80%且Uniq Reads≥2 500 000為質(zhì)控合格樣本。將獲得的DNA樣本調(diào)整至10～60 mg/L供STR分型檢測和DNA文庫建庫使用。

1.3CNVs檢測

1.3.1 DNA文庫的構(gòu)建、定量和CNV-Seq檢測 把質(zhì)控合格的DNA使用CNV-Seq檢測試劑盒(可逆末端終止測序法，杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司)進行文庫構(gòu)建。具體操作包括在DNA中加入核酸內(nèi)切酶，把基因組DNA隨機酶切后，將酶切產(chǎn)物的DNA末端補平，通過增加一個腺嘌呤脫氧核苷酸使得其與測序引物相連后獲得文庫DNA，并使用高通量測序文庫構(gòu)建DNA純化試劑盒(磁珠法，杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司)進行DNA文庫純化。將純化過的產(chǎn)物稀釋后使用qRT-PCR進行定量，根據(jù)DNA文庫濃度的大小調(diào)整每個樣本加入混合上樣體系的體積，將混合體系再次定量以確定最終上機的終濃度，調(diào)整上機體積后使用NextSeq CN500(Illumina)基因測序儀檢測。

1.3.2 生物信息學(xué)分析 以片段拷貝數(shù)(segment copy number，SCN)的數(shù)值作為判定染色體檢測區(qū)拷貝數(shù)的依據(jù)。將測序得到的reads與hg19參考基因組進行比對，對參考基因組進行區(qū)間劃分，統(tǒng)計每個區(qū)間上的唯一比對數(shù)，并計算其與陰性對照中該區(qū)域唯一比對數(shù)的比值，之后采用GDSW算法鑒定染色體異常或CNVs。結(jié)果與DECIPHER、DGV、OMIM等數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.4STR分型檢測把質(zhì)控合格的DNA樣本加入配置好的GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)20A試劑盒(北京基點認知技術(shù)有限公司)擴增體系中進行擴增；使用ABI 3500基因分析儀將獲取的擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳后獲得不同分型的相對定位，使用Gene Mapper軟件對檢出的不同分型進行分析。

1.5單核苷酸多態(tài)性芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)驗證使用Affymetrix CytoscanTM750 k芯片進行CNV檢測分析。通過對質(zhì)控合格的基因組DNA酶切、連接、擴增之后，將產(chǎn)物純化、片段化、標(biāo)記，最后進行雜交和掃描，將得到的數(shù)據(jù)使用ChAS 3.0系統(tǒng)進行分析，結(jié)果與DECIPHER、DGV、OMIM等數(shù)據(jù)庫進行比對。

2 結(jié)果

545例孕早期SA胚胎組織全部獲得了CNV-Seq檢測和STR分型結(jié)果。兩種平臺聯(lián)合應(yīng)用共檢出遺傳物質(zhì)異常樣本300例，陽性率為55.1%。其中，三倍體樣本為190例(34.9%)，性染色體單體樣本為39例(7.2%)，其他非整倍體型樣本9例(1.7%)。通過聯(lián)合STR分型額外檢出異常樣本39例，包括三倍體樣本30例，單親二倍體樣本6例，其他異常樣本3例。所有分類詳見表1。使用SNP-array平臺對STR分型檢出的6例單親二倍體樣本進行驗證，驗證結(jié)果支持STR分型結(jié)果(圖1)。

A：STR分型示意圖，結(jié)果顯示標(biāo)本2、3、4、5、6、7、8、11、12、13、15、16、18、19以及21號染色體上STR基因座均為純合；B：SNP-array提示該標(biāo)本存在雜合性缺失

表1 CNV-Seq與STR分型聯(lián)合檢測結(jié)果

續(xù)表1

另外，在23例樣本中檢出了SA的CNVs，其中15例樣本中存在兩個以上CNVs，12例樣本同時存在基因組片段微重復(fù)和微缺失(表2)。對于高度懷疑為平衡易位的樣本(序號21)，對其父母進行了染色體核型分析，該樣本2號染色體的p25.3至p13.3區(qū)存在68.74 Mb重復(fù)，11號染色體的q25區(qū)存在3.42 Mb缺失；染色體核型分析結(jié)果顯示其父親為46,XY,t(2;11)(p13;q25)的染色體平衡易位攜帶者(圖2)。

表2 CNV-Seq技術(shù)檢出的可能為導(dǎo)致孕早期SA的23例樣本的CNVs

A：表2中序號21樣本的CNV-Seq檢測結(jié)果，示2號染色體短臂末端存在68.74 Mb重復(fù)，11號染色體長臂末端存在3.42 Mb缺失；B：胚胎父親的染色體核型分析結(jié)果為46, XY, t(2;11)(p13;q25)

3 討論

SA屬于妊娠常見的并發(fā)癥[7]。20世紀(jì)70年代到90年代，美國和中國的SA發(fā)生率都在逐步增加[8-9]。多年來行業(yè)一直以染色體核型分析作為診斷染色體畸變的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其分辨率較低、細胞培養(yǎng)周期長等原因，尤其是針對流產(chǎn)組織樣本容易培養(yǎng)失敗的特點，僅靠核型分析已逐漸不能滿足臨床檢測需求[10]。臨床亦常用染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis, CMA)這種比染色體核型檢測分辨率高的技術(shù)進行全基因組CNV檢測，主要用于檢測常規(guī)染色體核型方法無法檢出的微小基因片段的重復(fù)和缺失，尤其是小于5 Mb的片段的重復(fù)缺失[11]。但CMA技術(shù)的檢測成本較高且通量較小，對于批量檢測流產(chǎn)組織CNV具有一定的限制性，并且CMA技術(shù)對樣本DNA的質(zhì)控要求相對較高，使用芯片的雜交探針位置分布相對有限且固定，對于基因組CNV的檢測的不夠靈活。基于以上原因，作者使用了基于二代測序的CNV-Seq平臺，其除了與CMA技術(shù)同樣可以覆蓋整個基因組進行檢測之外，還具有更多優(yōu)勢：首先CNV-Seq檢測的是被酶切隨機打斷的基因組片段，測序更具有隨機性；其次，CNV-Seq技術(shù)的分辨率更高，基因組上每20 kb就有一個檢測位點，可檢出100 kb以上的CNVs，檢測結(jié)果精度更高[5]；另外，相比CMA芯片檢測，一次可完成更多的樣本檢測，節(jié)省時間和成本，在經(jīng)濟角度上的可選擇性較高。因此CNV-Seq技術(shù)被逐漸推廣應(yīng)用于臨床。本研究對于已檢出的高度懷疑為平衡易位的樣本進行了父母的染色體核型分析驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5例胚胎組織的父母中存在平衡易位攜帶者，這些檢測分析為本次妊娠不良查明了原因，也為他們以后再次妊娠提供了遺傳學(xué)的風(fēng)險評估。另外，作者在24例樣本中檢的CNVs，通過分析父母來源、區(qū)域內(nèi)包含基因以及數(shù)據(jù)庫等判斷為臨床意義不明確。

但CNV-Seq技術(shù)本身也有其局限性，其對于多倍體、染色體易位重排倒位、特殊嵌合體、單親二倍體等樣本有無法檢出的缺點，所以在對流產(chǎn)組織進行CNV檢測時需要一些輔助檢測手段來幫助結(jié)果分析。本研究選擇了545例早期SA胚胎組織進行CNV-Seq檢測，聯(lián)合STR分型對實驗結(jié)果進行分析，正是出于CNV-Seq技術(shù)的局限性這一情況考慮的結(jié)果。CNV-Seq技術(shù)對于三體樣本的檢出率很高，對于CNV-Seq技術(shù)不能檢測出的多倍體以及單親二倍體等樣本，通過STR分型可獲得良好分析。69,XXY和69,XYY型樣本在CNV-Seq平臺上表現(xiàn)為X染色體和Y染色體嵌合，69,XXX則與46,XX型樣本的結(jié)果相同，但通過STR分型則可以較清楚地分辨出這些樣本的染色體數(shù)目。同樣，單親二倍體在CNV-Seq平臺上的檢測結(jié)果與46,XX型樣本的結(jié)果相同，但STR分型則可以輕易分辨出其檢測位點均為雜合性缺失。作者進一步應(yīng)用SNP-array平臺對疑似單親二倍體的樣本進行了檢測，結(jié)果與應(yīng)用STR分型分析的結(jié)果一致。

本研究檢出異常染色體樣本陽性率為55.1%，與既往研究[6,12]中檢出的陽性率以及染色體變異方式較為一致。兩種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用診斷陽性率比單獨應(yīng)用CNV-Seq平臺診斷的陽性率提高了7.2%。這說明對于早期SA胚胎組織檢測來說，雖然CNV-Seq技術(shù)診斷效率較高，但STR分型分析對于早期SA原因的分析也是必要的。因此以CNV-Seq為主，STR分型聯(lián)合檢測這一方法在早期SA胚胎的病因分析中的應(yīng)用是非常有價值的。