圓頭精子癥患者精子形態觀察及全外顯子測序分析

王紅梅，李文悌，莊春波，張世杰，李興武

鄭州大學第一附屬醫院檢驗科 鄭州 450052

男性原因引起的不孕不育占整個不孕不育的近50%。圓頭精子癥(globozoospermia)是一種嚴重且罕見的精子畸形[1-2]，在男性不育癥中占比不足0.1%，主要表現為精子頭部呈正圓形，頂體缺陷或缺失，伴隨尾部異常[3-4]，由于其頂體酶減少或缺失從而使得精子不能順利穿過卵子透明帶，不能與卵子結合而引起不育。圓頭精子癥產生的確切原因與機制還不十分明確，有報道[5-7]其與多種基因異常有關，如精子發生相關基因16 (spermato-genesis associated 16，SPATA16)、編碼跨膜結構域蛋白的基因DPY19L2等。本研究對1例圓頭精子癥患者的精液進行常規分析和形態學觀察，并利用全外顯子測序技術探討其基因變異情況。

1 對象與方法

1.1研究對象男性，34歲，婚后8 a(未采取避孕措施5 a)未育，體格健壯。泌尿外科常規體檢：第二性征明顯,無過敏史,無心、肺、肝等實質臟器疾患,無吸煙、酗酒等不良習慣；B超示睪丸、輸精管、附睪、精索靜脈均正常；傳染病四項均陰性，促卵泡生成素(FSH)、泌乳素(PRL)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、黃體酮(PROG)、睪酮(TESTO)均正常，遺傳核型為46,XY，精漿生化檢測(酸性磷酸酶、中性α-糖苷酶、果糖、乳酸脫氫酶X)均正常，精子頂體酶活性降低，為45.7 μIU/106個精子(參考值≥64.9 μIU/106個精子)。禁欲5 d后手淫取精液于專用無菌大試管中，立即送實驗室進行精子質量分析和形態學分析。同時選取健康有生育能力的志愿者的精液一并做形態學分析。本研究已通過鄭州大學第一附屬醫院科研和臨床試驗倫理委員會審查，倫理審查編號：2019-KY-131。

1.2精液常規分析及精子形態學分析按第5版《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》，分別取患者和志愿者精液2 μL滴于進口專用計數池，置于西班牙SCA精子質量分析系統進行精子質量分析。分別將患者精液及志愿者精液2 μL滴于GoldCyto Spermblue精子形態染色分析玻片上，用加樣槍尖順時針、逆時針適當攪動，使標本與染液充分混合，加一次性蓋片，56 ℃加熱5 min，置OlympusCX31顯微鏡(×100)下觀察并計數異常形態精子數，計算精子頭部畸形率及圓頭精子率。

1.3全外顯子測序取患者靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝，送上海明碼生物科技有限責任公司進行基因全外顯子測序。測序流程如下：提取外周全血基因組DNA，依次進行末端補平、3’端腺苷化、接頭連接、片段選擇及擴增，完成 DNA 文庫構建。然后使用安捷倫全外顯子組目標區域捕獲探針進行雜交，使用磁珠捕獲雜交的目的片段并分離純化。PCR擴增捕獲的DNA 片段并純化PCR產物，然后進行捕獲文庫質檢。調整待測DNA文庫濃度，按照Illumina的標準流程進行高通量測序。最后對測序數據進行分析，使用ClinVar、OMIM 和HGMD數據庫篩選可疑的致病變異。

1.4實時熒光定量PCR檢測DPY19L2基因拷貝數變異分別取患者及健康對照者靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝。采用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取患者血液基因組DNA，采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ reagent (TaKaRa公司) 試劑盒檢測DPY19L2基因拷貝數相對水平。利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物，DPY19L2上游引物5’-TAGCCAAGGGAAGCCGTGAT-3’，下游引物5’-AGCCATGTGCGGGATGTAAT-3’, 由上海生工生物科技有限公司合成。PCR反應體系20 μL，含上、下游引物各0.8 μL、10 μL TB Green、2 μL DNA模板、0.4 μL ROX以及6 μL無核酸酶水。PCR反應在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行，反應條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，擴增40個循環。以健康男性基因組DNA為對照，采用2-ΔCt(ΔCt=Ct患者-Ct對照)法計算患者DPY19L2基因拷貝數相對水平。患者和健康對照樣本各做3個復孔。

1.5Sanger測序檢測單核苷酸變異取患者靜脈血3 mL,抗凝，提取基因組DNA。根據DNAH1基因NM_015512.4:c.871+3G>A和ZMYND10基因NM_015896.2:c.833G>C 變異位點設計特異性引物。DNAH1上游引物5’-GCTTTCTTCCAGGTATTT GACAA-3’，下游引物5’-TGTCTACCAGCTGAGAG GTCTTG-3’；ZMYND10上游引物5’-AAAAGAG CACTGGGGTTGAG-3’，下游引物5’-GCTGGCT CACTTGAAGAGAATT-3’。使用 PCR 擴增試劑盒(TaKaRa公司)對靶序列進行擴增，反應體系20 μL，含上、下游引物各0.8 μL，10 μL TB green，2 μL DNA模板，0.4 μL ROX以及6 μL無核酸酶水。反應條件如下：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增40個循環。PCR產物送上海生工生物科技有限公司進行Sanger測序，測序結果與GenBank數據庫中的參考序列進行比對。

2 結果

2.1精液常規分析及精子形態分析結果精液pH 7.5，精子活動率56.0%，前向運動(PR)：22.4%，非前向運動(NP)：33.6%，無運動(IM)：44.0%。精子密度32.7×106個/mL。 精子形態分析結果：精子頭部畸形率100%，均為圓頭精子，缺乏頂體(圖1)。

圖1 患者(左)和健康對照(右)的精子形態

2.2全外顯子測序結果分析及驗證該患者DPY19L2基因區域測序深度降低，提示DPY19L2基因純合缺失，并攜帶DNAH1(c.871+3G>A)和ZMYND10 (c.833G>C，p.Arg278Pro)基因雜合突變。與健康對照相比，該患者DPY19L2基因拷貝數相對水平明顯降低，僅為正常水平的30%[(0.293±0.109)vs(1.001±0.025)]，提示存在DPY19L2基因純合缺失。此外，對單核苷酸變異的驗證結果顯示，該患者確攜帶DNAH1基因c.871+3G>A雜合突變和ZMYND10 基因c.833G>C雜合突變(圖2)。

A：患者DNAH1基因存在c.871+3G>A雜合突變；B：DNAH1正常基因型；C：患者ZMYND10基因存在c.833G>C雜合突變；D：ZMYND10正常基因型

3 討論

雖然圓頭精子癥在不育男性中的發病率低于0.1%，但臨床上并不十分罕見，根據嚴重程度可分為兩種類型：Ⅰ型，精子頭部完全不存在頂體和頂體酶；Ⅱ型，精子保留殘余頂體或存在其他形態類異常。安娜等[8]曾在透射電鏡下觀察圓頭精子的超微結構，顯示精子質膜破損，頂體缺失，細胞核內含有空泡，線粒體空泡化且排列雜亂，堆疊在一起，微管的9+2結構不明顯，精子頸部或尾部卷曲。用超高倍精子放大系統或傳統光學顯微鏡雖然無法觀察精子內部的超微結構，卻能較清晰地觀察精子的外部形態，染色后能清晰地觀察到精子頂體、胞核，以及空泡等，圓頭精子卻看不到頂體。由于頂體內含有精子與卵母細胞受精所需要的酶類，因此在女性體內缺乏頂體的異常精子不能順利穿過卵子的透明帶，就無法使卵母細胞受精，患者表現為不育[9]。

關于圓頭精子癥導致男性不育的確切機制目前尚不明確，文獻[10]報道顯示超過 80%的圓頭精子癥的發生是由于DPY19L2基因缺失導致。Alvarez等[11]的研究顯示，DPY19基因家族包括4個基因：DPY19L1、DPY19L2、DPY19L3和DPY19L4。DPY19L2基因的突變導致功能性DPY19L2蛋白的喪失，可導致精子生成障礙9型[MIM：613958]，從而導致精子頭部延長和頂體發育障礙。但是，圓頭精子癥患者除不育之外，并未發現其他特殊癥狀和體征，染色體和Y染色體微缺失均未見異常。本研究未檢測到明確的導致圓頭精子癥的致病基因或變異，也未發現與其表型相關的點變異及小片段插入缺失變異，卻發現DPY19L2基因部分區域測序深度降低，提示DPY19L2基因純合缺失。該大片段缺失變異曾在多例圓頭精子癥患者中被檢測發現。Koscinski等[10]對4例圓頭精子癥患者的檢測發現DPY19L2基因有約200 kb的純合缺失。另有研究[12]發現，54名圓頭精子癥患者中多名患者受累于該基因的純合缺失。該患者精液常規分析均在正常值范圍內。

該研究結果同時顯示全外顯子測序檢測到DNAH1基因、ZMYND10基因存在變異，其基因變異信息分別為NM_015512.4:c.871+3G>A和NM_015896.2:c.833G>C(p.Arg278Pro)，均屬于雜合子突變，分別可能引起精子生成障礙18型[13][MIM:617576]和原發性纖毛運動障礙22型[14][MIM:615444]，表現為精子鞭毛的多種形態學缺陷和男性不育，然而這兩個基因變異目前尚不能判定與圓頭精子癥有關，有待進一步研究。

總之，圓頭精子癥基因缺陷表現多樣，DPY19L2基因純合缺失可能是本例圓頭精子癥的發病原因。