鹽質量分數對魚頭湯熬煮過程中微納米顆粒形成的影響

翟爭妍，樊馨怡，陶寧萍,2,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306）

作為一種大型遠洋性魚類，金槍魚以其非常高的營養價值享譽全球水產品市場。經濟價值高的金槍魚有6 種，分別是藍鰭金槍魚、大眼金槍魚、黃鰭金槍魚、長鰭金槍魚、北方黑鮪和鰹魚，其中屬瘦肉型的大眼金槍魚因肉質鮮嫩、生食味美且捕撈量較高，是目前市場上制作生魚片的主要原料[1-2]。但是在金槍魚加工過程中會產生魚內臟、魚頭、魚皮、魚骨等大約70%的副產物[3]，作為主要副產物之一的金槍魚頭富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、蛋白質以及多種生物活性物質[4-5]。目前，對于金槍魚頭的利用主要集中在生產蛋白質酶解產物以及提取粗魚油。楊萍等[6]研究了大眼金槍魚蛋白酶解產物經過超濾所得1 ku組分的抗氧化能力，1 ku的組分在進行體外實驗時表現出一定的還原能力，在進行體內實驗時能夠顯著提高衰老小鼠的抗氧化能力。Tao Ningping等[7]采用超臨界CO2萃取法提取黃鰭金槍魚眼窩肉中的魚油，結果表明，提取的DHA占總脂肪酸的27.1%。劉書成等[8]采用酶解法從金槍魚頭中提取魚油，經過理化分析得知，提取的魚油中包含23.63%的DHA和4.84%的EPA。通過中國傳統烹調方式將金槍魚頭熬煮成魚頭湯，既能夠保證魚頭中營養成分的充分利用，又能夠豐富湯類產品的市場，提高魚頭的食用價值和經濟價值；因此，本實驗以金槍魚頭為材料，通過熬煮對該副產物進行利用研究。

食鹽（NaCl）作為食品加工生產過程中最常使用的添加劑之一，在肉類、乳制品、烘焙食品和湯的加工、保藏以及感官可接受性方面發揮著十分重要作用[9]。除此之外，由于NaCl還可以通過增加蛋白質與脂肪之間的結合能力，起到促進乳化的作用，因此其在食品乳液的形成與穩定過程中扮演著重要的角色。馮美琴等[10]研究不同NaCl濃度對O/W乳液穩定性的影響時發現，隨著NaCl濃度的增加，乳液的穩定性呈現先提高后降低的趨勢。Inguglia等[11]研究結果表明，在肉制品的加工過程中，NaCl可以通過增強蛋白質和脂肪之間的結合從而促進熱穩定性乳液的形成。

食品原料作為一種多相分散系統，通常含有大量的兩親化合物，在其加工過程中會受到各種結合力的影響，并且通過共價和非共價相互作用，分子間會產生大量的自組裝膠體顆粒，其尺寸分布范圍從微米到納米，即微納米顆粒（micro/nano particles，MNPs）[12]。研究表明熬煮1 h后的蛤蜊湯中含有平均粒徑為78 nm的MNPs[13]。湯中的MNPs還有一定的營養功效，如豬骨湯中的MNPs具有抗氧化作用[14]。然而，在魚湯熬煮過程中有關鹽對MNPs的形成以及穩定性的影響卻鮮有報道。

本實驗以金槍魚頭湯為研究對象，探究鹽質量分數對金槍魚頭熬煮過程中營養物質遷移規律的影響。同時以平均粒徑、聚合物分散性指數（polymer dispersity index，PDI）和Zeta-電位為評價指標，研究加鹽質量分數對熬煮過程中MNPs形成的影響。利用光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡研究鹽質量分數對金槍魚頭湯中MNPs形態及其組分之間相互作用的影響，為金槍魚頭湯的精深加工提供理論依據，實現金槍魚副產物的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大眼金槍魚頭（Thunnus obesus）（同批次30 條，體長（27.09±2.04）cm、體寬（25.69±1.00）cm、體質量（1.52±0.19）kg）購自大連翔祥食品有限公司；食鹽、大豆油為市售。

五水硫酸銅、濃硫酸、蒽酮、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三氯乙酸、高氯酸、氯仿、甲醇等均為分析純；正己烷、三氯甲烷、三氟化硼甲醇均為色譜級；尼羅紅上海麥克林生物科技有限公司；3 種核苷酸標準品、十九烷酸、十九烷酸甲酯、37 種脂肪酸甲酯混合標準品上海安譜科學儀器有限公司；CoroNa? Green、MQAE美國賽默飛世爾科技有限公司；Rhod-PE、尼羅藍美國Avanti Polar Lipids公司；WGA488染液 美國Biotium公司。

1.2 儀器與設備

C21-WT2112T美的電磁爐 廣東美的網絡科技有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋 上海恒科學儀器有限公司；Tracegcultra氣相色譜儀 美國Thermo Fisher公司；L-8800氨基酸自動分析儀 日本日立公司；UV-2200紫外分光光度計 美國Unico公司；RV 10旋轉蒸發儀 德國IKA集團；1260液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；ZEN 3600納米粒度電位儀 英國馬爾文儀器有限公司；MS500W倒置光學顯微鏡 上海明茲精密儀器有限公司；LSM710 NL0激光共聚焦顯微鏡德國蔡司股份公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參考錢雪麗等[15]的方法熬煮金槍魚頭湯，煮沸開始計時并加鹽，經過感官預實驗確定鹽質量分數使用范圍，即0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%。魚頭湯熬煮過程中每隔30 min取一次樣，過濾，分裝在50 mL小瓶并于-70 ℃進行保藏。

1.3.2 總脂質量濃度的測定

總脂質量濃度的測定參考Folch等[16]的方法并略作修改。向錐形瓶中加入20 mL的魚頭湯和400 mL氯仿/甲醇（2∶1，V/V）溶液，振蕩搖勻后于4 ℃的冰箱中放置24 h。然后過濾以除去混合液中的不溶性物質。加入質量分數為0.9%的NaCl溶液并搖勻，靜置分層后除去上層的甲醇，重復兩次。最后使用旋轉蒸發儀除去三氯甲烷得到總脂，稱質量并計算得出總脂質量濃度。最后充入氮氣，并于-70 ℃保存以用于EPA和DHA含量的測定。

1.3.3 EPA和DHA含量的測定

取0.08～0.10 g總脂于100 mL圓底燒瓶中，參照Zhang Jing等[17]的方法對其進行甲酯化后，采用氣相色譜法對EPA和DHA含量進行檢測。

1.3.4 水溶性蛋白質量濃度的測定

參考Lowry等[18]的研究，采用Folin-Ciocaileu法測定水溶性蛋白質量濃度。先用超純水將5 mL的魚頭湯稀釋至100 mL，之后再取1 mL稀釋至10 mL。取1 mL的樣品和5 mL的Folin-Ciocaileu試劑A液混合并于40 ℃加熱30 min，然后加入0.4 mL的Folin-Ciocaileu試劑B液混合并再次加熱10 min。最后在500 nm波長處測定樣品的吸光度并計算水溶性蛋白質量濃度。

1.3.5 游離氨基酸質量濃度的測定

游離氨基酸質量濃度的測定參考Tanimoto等[19]的方法并略作修改。取2.0 mL魚頭湯和15 mL質量分數為5%的三氯乙酸于離心管中并勻漿，將勻漿的樣品超聲5 min后于4 ℃條件下靜置2 h。然后離心（10 000 r/min、4 ℃）10 min，取5 mL上清液置于10 mL燒杯中，然后用6 mol/L的NaOH溶液調節上清液的pH值至2.0，并用超純水定容至10 mL，過0.22 μm的水相尼龍濾膜后收集到棕色進樣瓶中。最后使用氨基酸自動分析儀進行檢測分析，其參數條件為：色譜柱規格4.6 mm×150 mm，7 μm；柱溫50 ℃；通道1流速0.4 mL/min；通道2流速0.35 mL/min；流動相為pH值分別為3.2、3.3、4.0、4.9的檸檬酸鈉和檸檬酸的混合緩沖液以及質量分數4%的茚三酮緩沖液。

1.3.6 低聚肽質量濃度的測定

低聚肽質量濃度的測定參考曾清清[20]的方法并略作修改。首先在離心管中加入2 mL魚頭湯和2 mL質量分數為2%的三氯乙酸，混勻后以4 000 r/min離心10 min。取1.5 mL上清液和1.5 mL質量分數為6%的NaOH溶液于試管中并搖勻，加入0.15 mL的雙縮脲試劑并于漩渦振蕩器上振蕩搖勻。在室溫條件下靜置15 min后，利用紫外分光光度計在310 nm波長處測其吸光度。以牛血清白蛋白為標準品。

1.3.7 總糖質量濃度的測定

總糖質量濃度參考Fan Xinyi等[21]的方法，采用硫酸-蒽酮法進行測定。將20 mL的魚頭湯倒入50 mL燒瓶中，向燒瓶中加入10 mL鹽酸，然后在100 ℃的沸水中加熱20 min。將混合物放入冰水中冷卻至室溫（25 ℃），過濾，然后用蒸餾水定容至100 mL。取10 mL樣品溶液稀釋10 倍，之后再取1 mL置于試管中，將4 mL蒽酮試劑（1 g蒽酮溶于500 mL體積分數80%的硫酸溶液中）加入試管并充分混合。然后將試管在100 ℃加熱10 min，取出并置于冰水中冷卻20 min，最后在620 nm波長處測其吸光度。

1.3.8 5’-核苷酸質量濃度的測定

5’-核苷酸質量濃度的測定參考Qiu Weiqiang等[22]的方法并略作修改。取5 mL魚頭湯和10 mL質量分數為10%的高氯酸于離心管中并勻漿2 min。超聲處理5 min后，使用冷凍離心機離心（10 000 r/min、4 ℃）15 min并取上清液于25 mL燒杯中。再取5 mL質量分數為5%的高氯酸于離心管中，與離心管中沉淀混勻后離心（10 000 r/min、4 ℃）15 min。合并兩次上清液于25 mL燒杯中，使用6 mol/L的氫氧化鉀溶液調節pH值至5.8。然后靜置30 min，取上清液并用超純水定容到50 mL。過0.22 μm的水相尼龍濾膜后收集到棕色進樣瓶中，之后在高效液相色譜儀中進行分析檢查。整個過程全部都在4 ℃下進行。色譜條件：色譜柱：Venusil XBP C18液相色譜柱（3.9 mm×150 mm，5 μm）；流動相：A為20 mmol/L磷酸二氫鉀和20 mmol/L磷酸氫二鉀的混合溶液，并用磷酸調節pH值至5.8；B為甲醇溶液；等度洗脫流速：1 mL/min；柱溫：28 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：254 nm。

1.3.9 MNPs平均粒徑、PDI和Zeta-電位的測定

MNPs平均粒徑、PDI和Zeta-電位的測定參考馮美琴等[10]的方法并略作修改。將湯用煮沸后的去離子水稀釋10 倍，攪拌均勻。使用馬爾文納米粒度分析儀測定金槍魚頭湯中MNPs的平均粒徑和PDI，其中MNPs的折射率為1.440 4，分散劑為水，分散折射率為1.330。

1.3.10 光學顯微鏡觀察MNPs的形態變化

參考Qian Xueli等[23]的方法。將金槍魚頭湯過濾，取20 μL樣品滴到載玻片上并將蓋玻片緩慢覆蓋到上面。使用MS500W倒置光學顯微鏡（×40目鏡）觀察不同鹽質量分數在熬煮150 min后對金槍魚頭湯中MNPs形態特征的影響。

1.3.11 激光共聚焦顯微鏡觀察MNPs中各組分之間的相互作用

首先，將金槍魚頭湯過濾以除去不溶性雜質。染料配制及魚湯染色過程中均應避光操作以防止熒光染料見光猝滅。配制尼羅紅（42 μg/mL，丙酮配制）[24]、MQAE（5 mg/mL，二甲基亞砜配制）[25]、CoroNaTMGreen（500 μg/mL，二甲基亞砜配制）[26]、Rd-DOPE（1 mg/mL，氯仿配制）[27]、尼羅藍（210 μg/mL，乙醇配制）[28]、WGA488（1 mg/mL，磷酸鹽緩沖液配制）[29]染液。然后將100 μL尼羅紅、40 μL MQAE以及40 μL CoroNaTMGreen加入至1 mL處理過的魚湯中，對湯中甘油三酯、Cl-和Na+進行染色；將20 μL Rd-DOPE、10 μL尼羅藍和10 μL WGA488加入1 mL處理過的魚湯中，對湯中磷脂、蛋白質和糖基化分子（糖脂和糖蛋白）進行染色。然后在黑暗的條件下靜置30 min使湯中物質得到充分染色。然后取10 μL染色后的樣品于載玻片上，并用蓋玻片覆蓋。室溫下于黑暗條件下放置20 min待其晾干。最后使用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，選擇63×1.4油鏡用于成像，并使用在488 nm激發的氬激光器（在500～535 nm之間檢測到發射波長）、在543 nm激發的He-Ne激光器（在565～615 nm之間檢測到發射波長）和在633 nm激發的二極管激光器（采用長通濾波器大于650 nm檢測）。

1.4 數據處理與分析

所有實驗均重復3 次，結果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS 16.0軟件根據單因素方差法對數據進行差異顯著性比較分析，P＜0.05表示數據之間存在顯著性差異。采用GraphPad Prism 5和Origin 8.0軟件處理和生成圖像。

2 結果與分析

2.1 營養物質的遷移規律

在熬煮這一典型的食品加工過程中，營養物質會從金槍魚頭的內部向表層遷移，接著再從表層向湯中遷移[12]。由圖1可知，隨著熬煮時間的延長，湯中營養物質的溶出量逐漸增加并在熬煮150 min時后達到最大，這與Qian Xueli等[23]的研究結果一致，表明加鹽并不會改變熬煮過程中營養物質遷移的總體趨勢。分析鹽質量分數對營養物質遷移的影響可以看出，隨著鹽質量分數的增加，湯中營養物質的溶出量總體呈現先增加后減少的趨勢，并在0.5%的條件下達到最大。其原因可能是隨著鹽質量分數從0.3%增加到0.5%，湯熬煮過程的滲透壓增大，有利于營養物質的溶出。但當鹽質量分數從0.5%增加到0.7%時，較高的鹽質量分數會促使湯中營養物質與NaCl發生相互作用，導致營養物質含量減少[30-31]。

圖1 鹽質量分數對金槍魚頭湯熬煮過程中營養物質遷移的影響Fig.1 Effect of salt concentration on the migration of nutrients during the cooking of tuna head soup

2.2 營養物質遷移規律的主成分分析結果

表1 特征值與貢獻率Table 1 Eigenvalues and contribution rates

主成分分析是一種數學工具，它可以降低數據的維數，使實驗數據中的底層結構和數據與樣本之間的關系可視化。對6 種不同鹽質量分數魚頭湯的營養物質遷移規律進行主成分分析，得到魚頭湯營養品質的7 個主成分特征值及累計方差貢獻率（表1）。由表1可知，第1主成分的特征值為5.878，其累計方差貢獻率為83.965%。當累計方差貢獻率大于70%時，表明第1主成分已經包含了魚湯的絕大部分信息，此結果與Qian Xueli等[23]所報道的魚湯中MNPs主要是以甘油三酯為中心，外層主要包被磷脂雙分子層這一結論相一致。因此可以使用縮減的第1主成分來代替原來的7 個營養品質指標用以篩選最適的加鹽質量分數。

表2 第1主成分的載荷矩陣Table 2 Loading matrix of first principal component for seven nutrients

采用SPSS 20.0軟件對主成分進行分析得到的第1主成分的載荷矩陣（表2），載荷值主要反映各變量與主成分之間的相關系數，其絕對值越大，對第1主成分的影響越大。因此，由表2可知，第1主成分以總糖、水溶性蛋白以及脂質中的EPA和DHA的遷移量對其影響最為重要，其次是5’-核苷酸質量濃度，游離氨基酸質量濃度的影響最小。

表3 不同加鹽質量分數條件下魚頭湯的成分得分和綜合得分Table 3 Component scores and comprehensive scores of tuna head soup with different salt concentrations

由載荷矩陣可以得出，第1主成分得分與其他營養品質指標之間的線性關系：Z＝0.954X1+0.982X2+0.983X3+0.515X4+0.938X5+0.995X6+0.950X7。其中，X1～X7分別表示總脂、EPA和DHA、水溶性蛋白、游離氨基酸、低聚肽、總糖以及5’-核苷酸的水平。以第1主成分所對應的特征值的方差貢獻率及其線性關系建立綜合評價函數為：F＝Z/83.965。計算每個加鹽質量分數條件下魚頭湯的綜合得分，然后進行排序評價每個魚頭湯的營養品質。由表3可知，綜合得分由高到低的排序為0.5%、0.6%、0.7%、0.4%以及0.3%。其中當鹽質量分數為0.5%時，金槍魚頭湯的綜合得分為6.195 分，說明在該鹽質量分數下熬煮的魚頭湯營養品質的綜合品質最高。

2.3 不同鹽質量分數對MNPs形成的影響

圖2 鹽質量分數對金槍魚頭湯中MNPs形成的影響Fig.2 Effect of salt concentration on the formation of MNPs during the cooking of tuna head soup

金槍魚頭湯熬煮過程會因為受到各種結合力的影響通過共價或非共價的相互作用而自組裝形成大量的MNPs，為了判斷其穩定性，一般采用平均粒徑、PDI和Zeta-電位對其進行表征。由圖2可知，隨著熬煮時間的延長，MNPs的平均粒徑、PDI和Zeta-電位呈先增大后減小并趨于平穩的趨勢，表明湯中MNPs逐漸趨于不易聚集的穩定狀態。此外，含NaCl的湯中MNPs平均粒徑、PDI和Zeta-電位均小于不加鹽的魚頭湯。且隨著鹽質量分數的逐漸提高，湯中MNPs的平均粒徑、PDI和Zeta-電位呈先減小后增大的趨勢，這與馮美琴等[10]的研究結果相似。在鹽質量分數為0.5%時，MNPs的平均粒徑、PDI和Zeta-電位達到最小，意味著其重力減小且布朗運動可能完全克服重力帶來的影響，從而使得在湯放置的過程中MNPs不易發生聚集沉降，有利于營養物質的保留。

2.4 不同鹽質量分數對MNPs形貌的影響

圖3 不同鹽質量分數下熬煮150 min后金槍魚頭湯中MNPs的形貌圖Fig.3 Morphology of MNPs in tuna head soup boiled for 150 min with different salt concentrations

通過光學顯微鏡可以進一步觀察熬煮150 min后，不同加鹽質量分數條件下金槍魚頭湯中MNPs的形態變化（圖3）。不同加鹽質量分數條件下，湯中MNPs的形態存在比較明顯的區別。隨著鹽質量分數的增加，湯中MNPs的大小呈現先減小后增大的趨勢。在鹽質量分數為0.5%時，湯中MNPs的平均粒徑最小且分布較為均一，與鹽質量分數對MNPs平均粒徑和PDI影響的結果一致（圖2A、B）。此時湯中MNPs的尺寸較小，更易在小腸中被吸收，減少腸道營養吸收負擔。在鹽質量分數為0.3%～0.5%時，湯中MNPs的尺寸及其分布減小的原因可能是隨著鹽質量分數的增加，湯中溶出的鹽溶性球蛋白和陰離子多糖含量增加，使得越來越多的蛋白質和陰離子多糖結合在MNPs的表面，促使MNPs之間的靜電斥力增大并抑制MNPs之間發生聚集而使其尺寸減小。但是當鹽質量分數超過0.5%時，過量的鹽會屏蔽MNPs表面由陰離子多糖和蛋白質表面的羥基基團所提供的負電荷，導致其表面靜電斥力的降低。較弱的靜電斥力促使MNPs之間彼此接近并聚集形成尺寸較大的MNPs聚集體[23]。

2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察MNPs各組分之間相互作用

圖4 不同鹽質量分數下甘油三酯、Cl- 和分布Fig.4 Distribution of triglycerides, Cl- and Na+ in MNPs at different salt concentrations

圖5 不同鹽質量分數下磷脂、蛋白質和糖基化分子分布圖Fig.5 Distribution of phospholipids, proteins and glycosylated molecules(glycoproteins and glycolipids) in MNPs at different salt concentrations

從圖4可以看出，作為非極性分子的甘油三酯主要位于MNPs的中心；而由圖5可知，極性磷脂、蛋白質和糖基化分子這3 種兩親性物質則吸附在甘油三酯上從而在其表面形成了能夠良好連接水相和油相的膜結構，這與Qian Xueli等[23]的研究結果一致。其中蛋白質和多糖除了作為MNPs的基本組成部分之外，它們還能夠通過提高膜表面的黏彈性從而增加MNPs的穩定性。NaCl作為一種離子化合物，當被加入到湯中后，NaCl晶體在湯中會自動分解成Na+和Cl-。其中Cl-與甘油三酯結合，Na+與電負性的多糖和蛋白質表面的羥基結合。但是Na+和Cl-的存在會改變蛋白質與多糖之間的相互作用，從而導致MNPs的穩定性受到影響。在鹽質量分數為0.3%時，從圖4A和圖5A可以看出，湯中存在大小不一的MNPs，并由于小顆粒與大顆粒之間的溶解度和化學勢的差異，在MNPs不斷進行布朗運動的過程中，小顆粒會吸附在大顆粒的表面并形成粒徑更大的MNPs。當鹽質量分數增加到0.4%時（圖4B和圖5B），可以觀察到MNPs內部存在著磷脂、蛋白以及糖基化分子等兩親性物質。其原因可能是在該鹽質量分數條件下，MNPs之間的聚集雖然減少，但當其發生聚集時，甘油三酯之間的結合不緊密，破裂的膜結構就會處于甘油三酯的間隙中。而鹽質量分數為0.5%時（圖4C和圖5C），共聚焦顯微鏡的結果也進一步說明在該質量分數下，湯中MNPs的粒徑最小且尺寸分布最均一。隨著鹽質量分數增加到0.7%（圖4E和圖5E），MNPs的粒徑逐漸增大，與光學顯微鏡結果一致。

3 結 論

本實驗研究了加鹽質量分數對金槍魚頭湯中物質遷移以及MNPs形成的影響，結果表明，在1∶8魚水質量比、120 ℃油煎溫度煎40 s后再熬煮150 min的條件下，分別加鹽質量分數0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%，其中最適宜的加鹽質量分數為0.5%，此條件下營養物質的遷移量達到最大且營養品質優。當鹽質量分數為0.5%時，NaCl能夠促進MNPs的形成，此時湯中形成的MNPs具有穩定雙分子層以及最小的平均粒徑（（519.10±3.11）nm）。同時，Cl-滲透進入MNPs的中心并與甘油三酯結合，Na+則與分布在MNPs外圍的電負性多糖結合并抵消其負電荷。