納米魚骨對鰱魚肌球蛋白凝膠性能的影響

時浩楠，張夢玲，張 晉，尹 濤，胡 楊，尤 娟，熊善柏，劉 茹

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（武漢），湖北 武漢 430070）

魚骨是魚片和魚糜等水產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生的主要固體副產(chǎn)物之一，每100 g魚中含有10～15 g魚骨[1-2]。魚骨中鈣含量豐富，營養(yǎng)價值和生物利用率高[3]，是優(yōu)質(zhì)的天然鈣源。但目前魚骨主要被用于生產(chǎn)魚骨粉、低價飼料等[4]，或直接作為下腳料丟棄[5]，并未得到充分利用。魚糜凝膠制品因其食用方便、美味可口而深受消費(fèi)者歡迎[6]。肌球蛋白是魚糜形成凝膠最重要的功能性蛋白，加熱可使肌球蛋白變性，暴露的活性基團(tuán)間相互作用形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[7-8]。有研究表明，將魚骨尺寸降低至微米級能顯著提高魚骨的生物利用率、釋放率和溶解度等[9-10]，釋放出的鈣離子還能激活魚內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，進(jìn)而促進(jìn)肌球蛋白間的共價交聯(lián)，提高魚糜的凝膠強(qiáng)度[11-12]。納米魚骨（nano-scaled fish bone，NFB）對內(nèi)源性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶激活能力低于CaCl2，但對魚糜凝膠性能的增強(qiáng)效果卻優(yōu)于CaCl2[2]，說明加入NFB能夠增強(qiáng)凝膠性能不僅與Ca2+有關(guān)，還可能與NFB的魚骨尺寸有關(guān)。NFB安全無毒且生物利用率顯著高于微米魚骨（micro-scaled fish bone，MFB）[13-14]，因此，比較研究MFB和NFB對肌球蛋白凝膠特性的影響對魚骨的高值化利用具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)以鰱魚骨為原料制成NFB、MFB，并以CaCl2為對照，比較研究不同鈣源作用下肌球蛋白的靜態(tài)流變學(xué)性能、動態(tài)流變學(xué)性能，并結(jié)合肌球蛋白在加熱過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象變化及分子間相互作用，探討不同鈣源對肌球蛋白凝膠特性的影響，為將魚骨應(yīng)用于魚糜制品生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚（每條體質(zhì)量1 000～1 500 g）購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場。使用采肉機(jī)分離出魚骨，經(jīng)一次冰水漂洗后，于-18 ℃保存，提取肌球蛋白的原料為當(dāng)天購買的新鮮鰱魚肉。

牛血清白蛋白、三羧甲基氨基甲烷（Tris）（均為分析純） 美國Sigma Aldrich公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）（分析純）阿拉丁試劑（上海）有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1750型紫外-可見光分光光度計、RF-5301型熒光光譜儀 日本島津公司；Avanti J-26 XP高速冷凍離心機(jī)美國Beckman Coulter公司；AR2000ex型動態(tài)流變儀美國TA公司；MKCA6-2骨泥機(jī) 日本Masuko公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白提取及蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

參考Park等[15]的方法并稍作修改，僵直前的鰱魚脊背肉用食品調(diào)理機(jī)絞碎，加入10 倍體積含0.1 mol/L KCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02% NaN3和20 mmol/L Tris-HCl的緩沖液（pH 7.5），均質(zhì)1～2 min。均質(zhì)液于4 ℃下放置15 min后8 000 r/min離心5 min，去除上清液，將沉淀懸浮于5 倍體積含0.45 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.8，含5 mmol/Lβ-巰基乙醇、0.2 mol/L Mg2CO3、1 mmol/L乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸）中，同時加入ATP-Na2使肌球蛋白與肌動蛋白解離，ATP-Na2的終濃度控制為5 mmol/L。于4 ℃下放置1 h后，10 000 r/min離心10 min，用10 倍體積1 mmol/L KHCO3稀釋上清液，于4 ℃下放置15 min，然后12 000 r/min離心10 min。沉淀重新用2.5 倍體積含0.5 mol/L KCl和5 mmol/Lβ-巰基乙醇的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）懸浮，于4 ℃下放置15 min，再用2.5 倍體積的1 mmol/L KHCO3稀釋并加MgCl2至終濃度為10 mmol/L，于4 ℃下放置過夜，然后12 000 r/min離心15 min，所得沉淀溶于0.5 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）中，即得到肌球蛋白溶液。采用Lowry法[16]測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.2 MFB和NFB的制備

參考Yin Tao等[17]的方法，將魚骨蒸煮、漂洗、破碎后，加入1 倍質(zhì)量的冰水。微粒化處理制備MFB，處理?xiàng)l件：磨盤轉(zhuǎn)速3 000 r/min、磨盤間隙0.3 mm，研磨2 次。進(jìn)一步將MFB加水調(diào)整至總固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。納米化處理制備NFB，處理?xiàng)l件：磨盤轉(zhuǎn)速3 000 r/min、磨球填充率85%、磨球直徑0.5 mm、球磨時間6 h。所得MFB和NFB樣品的總鈣含量采用火焰原子吸收光譜法[18]測定。

1.3.3 樣品處理

根據(jù)不同指標(biāo)測定時對肌球蛋白溶液質(zhì)量濃度的要求，使用0.5 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）調(diào)整蛋白溶液質(zhì)量濃度，分別加入MFB、NFB和CaCl2，將樣品中總鈣濃度調(diào)至40 mmol/L（空白組不添加鈣離子），該樣品可直接用于流變學(xué)性能測試。用于其他指標(biāo)測試的肌球蛋白溶液還需進(jìn)行如下處理：1）未加熱處理：樣品不進(jìn)行加熱；2）S處理：40 ℃下加熱60 min；3）S+K處理：40 ℃下加熱60 min后90 ℃下加熱30 min。加熱后樣品立即用流水使其冷卻至室溫，于4 ℃冰箱保存，并在30 min內(nèi)測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.4 靜態(tài)流變學(xué)性能測定

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

采用AR2000ex型動態(tài)流變儀在flow模式下掃描，測定條件：蛋白質(zhì)量濃度10.0 mg/mL、溫度4 ℃、錐板直徑為40 mm（錐板與平臺角度2°）、載物臺與平板間距52 μm、數(shù)據(jù)獲取模式Continuous step，以剪切速率為變量（變量范圍0.1～1 000 s-1）、變量掃描模式為線性（linear）、采集變量點(diǎn)數(shù)為33，即可得到剪切應(yīng)力隨剪切速率變化曲線。采用Cross模型擬合其零剪切黏度，按公式（1）計算。

式中：η0為零剪切黏度/Pa；η∞為無窮剪切黏度/Pa；ηa為表觀黏度/Pa；k為黏度系數(shù)；n為流動特性指數(shù)；γ為剪切速率/s-1。

1.3.5 動態(tài)流變學(xué)性能測定

參考Ding Yuqin等[19]的方法并稍作修改，采用AR2000ex型動態(tài)流變儀在振蕩模式下和線性黏彈區(qū)的范圍內(nèi)進(jìn)行溫度掃描，測定條件：蛋白質(zhì)量濃度10.0 mg/mL、溫度4 ℃、夾板直徑40 mm、載物臺與平板間距1 mm。加熱程序分升溫階段（1 ℃/min從4 ℃升溫到90 ℃）和降溫階段（10 ℃/min 從90 ℃降溫到4 ℃）。其中，測試過程保持剪切應(yīng)力為1.0 Pa，升溫、降溫階段振蕩頻率為0.01 Hz，對樣品儲能模量G’、損耗模量G”和相位角δ的變化進(jìn)行測定。

1.3.6 表面疏水性的測定

參考Benjakul等[20]的方法，使用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將肌球蛋白溶液質(zhì)量濃度分別調(diào)整為0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL，按照1.3.3節(jié)對樣品進(jìn)行處理，使用ANS熒光探針劑測定表面疏水性。使用RF-5301型熒光光譜儀在激發(fā)波長374 nm（狹縫3 nm）和發(fā)射波長485 nm（狹縫3 nm）下測定熒光強(qiáng)度。通過一元線性回歸分析，以熒光強(qiáng)度-蛋白質(zhì)量濃度曲線的初始斜率表征表面疏水性。

1.3.7 活性巰基濃度的測定

參考Ellman法[21]測定活性巰基濃度，將肌球蛋白的質(zhì)量濃度調(diào)整至1.0 mg/mL，按照1.3.3節(jié)處理樣品。將5.5 mL的肌球蛋白溶液與100 μL Ellman試劑混勻，4 ℃下放置1 h，測其在412 nm波長處的吸光度。活性巰基濃度按公式（2）計算。

1.3.8 溶解度的測定

參考Riebroy等[22]的方法，將肌球蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整至1.0 mg/mL，按照1.3.3節(jié)處理樣品。取5 mL樣品在4 ℃下8 000×g離心10 min得上清液，使用Lowry法[11]測離心前后蛋白質(zhì)量濃度。溶解度為離心后蛋白質(zhì)量濃度與離心前蛋白質(zhì)量濃度的比例。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次做3 個平行，采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；應(yīng)用Origin 2018軟件作圖；采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件中Duncan’s法進(jìn)行顯著性分析，顯著水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 NFB對肌球蛋白靜態(tài)流變學(xué)特性的影響

圖1為不同鈣源作用下肌球蛋白表觀黏度（ηa）和剪切速率（γ）的關(guān)系曲線。空白組、NFB組和CaCl2組肌球蛋白分子在低剪切速率下表現(xiàn)出較高的黏度，這是肌球蛋白分子間相互纏繞導(dǎo)致的[23]。隨著剪切速率的增加，3 組肌球蛋白表觀黏度下降，均呈先迅速下降后下降速率變緩的趨勢，這是由于肌球蛋白分子按一定方向流動，流體阻力降低，導(dǎo)致表觀黏度下降而呈剪切稀化現(xiàn)象[24]。NFB組肌球蛋白與CaCl2組曲線最接近，ηa明顯高于另外兩組，這是由于NFB、CaCl2釋放出的Ca2+在4 ℃條件下有利于肌球蛋白分子之間形成鈣橋[25]。而MFB顆粒較大，易破壞蛋白質(zhì)之間的作用，且鈣釋放率較低，故其表觀黏度最低[2,14]。

圖1 不同鈣源作用下肌球蛋白的表觀黏度（ηa）和剪切速率（γ）的關(guān)系Fig.1 Relationship between apparent viscosity (ηa) and shear rate (γ) of myosin added with different calcium sources

表1 不同鈣源作用下肌球蛋白聚集體Cross模型擬合參數(shù)Table 1 Fitting parameters of Cross model for myosin aggregates added with different calcium sources

采用Cross模型對表觀黏度ηa和剪切速率γ關(guān)系進(jìn)行擬合，結(jié)果見表1（R2均大于0.958），所有特征參數(shù)n均小于1，表現(xiàn)為假塑性流體特性。CaCl2組肌球蛋白的黏度系數(shù)（k）和零剪切黏度（η0）顯著高于其他組，NFB組次之，MFB組肌球蛋白k和η0最小，這進(jìn)一步驗(yàn)證了CaCl2和NFB的加入能夠提高肌球蛋白之間的相互作用，使其流動性下降。而MFB可能破壞了蛋白質(zhì)之間的作用力，而增加了其流動性。

2.2 NFB對肌球蛋白動態(tài)流變學(xué)特性的影響

圖2A1～C1為升溫過程中不同鈣源作用下肌球蛋白動態(tài)流變學(xué)性能的變化。4 組肌球蛋白在升溫過程中變化趨勢類似，tanδ隨溫度升高而降低。在4～30 ℃升溫過程中G’呈下降趨勢，這可能由于在4 ℃條件下肌球蛋白形成的主要是不穩(wěn)定非共價鍵[26]，升溫破壞了該非共價鍵，使肌球蛋白流動性增強(qiáng)。30～38.8 ℃加熱過程中所有樣品G’均呈上升趨勢，其中空白組肌球蛋白上升幅度最小。40～45 ℃所有樣品G’輕微下降，這可能是由于肌球蛋白分子輕鏈解離使分子流動性增強(qiáng)或溫度升高，破壞了以氫鍵為主的低溫凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[27-28]。溫度高于45 ℃后所有樣品G’迅速升高，這是由于肌球蛋白分子間發(fā)生疏水相互作用及大量二硫鍵生成形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[24]。54.3～80 ℃加熱過程中NFB組G′明顯低于CaCl2組，繼續(xù)加熱至90 ℃，兩組肌球蛋白G’相近，這可能由于溫度升高促進(jìn)NFB釋放更多離子鈣，加強(qiáng)了分子間的疏水相互作用[8]，促進(jìn)了肌球蛋白的聚集。MFB的鈣釋放量低于NFB，且顆粒過大，影響了有序凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[11,14]；因此MFB組肌球蛋白繼續(xù)加熱G’下降。

如圖2A2～C2所示，整個降溫過程中，4 組肌球蛋白G’和G”都呈上升趨勢，且G’的增幅遠(yuǎn)大于G”，tanδ小幅度波動。這是由于降溫冷卻可促進(jìn)肌球蛋白分子間的氫鍵形成，有利于形成穩(wěn)定的凝膠體系。從90 ℃降溫至40 ℃時，3 組加鈣肌球蛋白的G’高于空白組。而從40 ℃降溫至4 ℃時，MFB組和NFB組肌球蛋白G’相近，低于CaCl2組，但明顯高于空白組。這是因?yàn)轸~骨所釋放的鈣離子促進(jìn)了肌球蛋白的膠凝，但其釋放的Ca2+含量低于CaCl2組。

圖2 不同鈣源作用下肌球蛋白的動態(tài)流變學(xué)性能Fig.2 Dynamic rheological properties of myosin added with different calcium sources

2.3 NFB對肌球蛋白表面疏水性的影響

表2為不同鈣源作用下肌球蛋白在加熱過程中表面疏水性的變化。CaCl2組和空白組肌球蛋白表面疏水性在加熱過程中呈上升趨勢，NFB組和MFB組肌球蛋白經(jīng)40 ℃加熱處理后表面疏水性上升，經(jīng)90 ℃加熱處理后下降。這是因?yàn)榧訜峒半x子鈣的加入促進(jìn)了肌球蛋白分子展開，使原包埋在分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露出來[23,29]；但繼續(xù)加熱會使暴露出的疏水性基團(tuán)因相互作用聚集，而導(dǎo)致表面疏水性降低。未加熱條件下NFB組肌球蛋白表面疏水性介于CaCl2組和空白組之間，MFB組表面疏水性最低。這可能是由于魚骨中鈣的釋放率與魚骨粒徑成反比，魚骨粒徑越小其鈣釋放率越高[9]。NFB可溶性鈣的釋放率顯著高于MFB，NFB可在4 ℃條件下誘導(dǎo)肌球蛋白分子構(gòu)象發(fā)生變化，使肌球蛋白分子表面疏水性升高。而MFB可能由于其顆粒較大使部分蛋白沉降，導(dǎo)致可與ANS熒光探針結(jié)合的蛋白含量減少而使表面疏水性下降。推測NFB組、MFB組肌球蛋白在40 ℃加熱階段時疏水性基團(tuán)暴露占主導(dǎo)，在90 ℃加熱階段形成了大量疏水相互作用。

表2 不同鈣源作用下肌球蛋白的表面疏水性Table 2 Surface hydrophobicity of myosin added with different calcium sources

2.4 NFB對肌球蛋白巰基含量的影響

表3為不同鈣源作用下肌球蛋白在加熱過程中活性巰基濃度的變化。未加熱條件下，與空白組相比，MFB組肌球蛋白活性巰基濃度增加，而CaCl2、NFB的加入對肌球蛋白的活性巰基濃度無顯著影響。經(jīng)40 ℃加熱60 min后，空白組、NFB組及CaCl2組活性巰基濃度顯著升高，且NFB組肌球蛋白活性巰基濃度介于CaCl2組和空白組之間；經(jīng)90 ℃加熱30 min后，NFB組和CaCl2組活性巰基濃度下降程度均高于空白組，說明NFB和CaCl2的添加促進(jìn)了蛋白質(zhì)間二硫鍵的形成。加熱過程中，MFB組肌球蛋白活性巰基濃度無顯著變化，這進(jìn)一步印證了顆粒較大的MFB干擾了二硫鍵的形成。此外，CaCl2所釋放的離子鈣含量高于NFB[14]，其活性巰基濃度變化也最高，推測活性巰基濃度的變化與所添加鈣源釋放的離子鈣濃度密切相關(guān)。Li Yanqing等[30]也得到了類似的結(jié)論，加熱及離子鈣的加入使蛋白的疏水結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，包埋在分子內(nèi)部疏水區(qū)域中的巰基基團(tuán)暴露在蛋白-水界面從而促進(jìn)活性巰基發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致活性巰基含量下降。

表3 不同鈣源作用下肌球蛋白的活性巰基濃度Table 3 Reactive sulfhydryl group contents of myosin added with different calcium sources mol/L

2.5 NFB對肌球蛋白溶解度的影響

溶解度可以反映蛋白的聚集情況，表4為不同鈣源作用下肌球蛋白在加熱過程中溶解度的變化。相同加熱條件下，MFB組肌球蛋白溶解度最高，NFB組溶解度介于空白組和CaCl2組之間，而CaCl2組最低，與鈣源的離子鈣釋放量趨勢剛好相反，這是由于Ca2+促進(jìn)了蛋白質(zhì)聚集，從而導(dǎo)致溶解度降低[31]；MFB則因?yàn)槠漕w粒較大破壞了蛋白質(zhì)間的相互作用，導(dǎo)致肌球蛋白聚集程度降低[11]。這與流變學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，進(jìn)一步說明了肌球蛋白經(jīng)加熱處理后溶解度均降低，蛋白質(zhì)分子經(jīng)加熱后結(jié)構(gòu)變得松散，α-螺旋向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[23]，原包埋在內(nèi)部的部分活性基團(tuán)暴露在表面，分子間形成疏水相互作用（表2）和二硫鍵（表3），導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，溶解度下降。NFB的添加有利于提高肌球蛋白凝膠特性。

表4 不同鈣源作用下肌球蛋白的溶解度Table 4 Solubility of myosin in the presence of different calcium sources %

3 結(jié) 論

靜態(tài)流變學(xué)結(jié)果表明，Cross模型可以很好地擬合肌球蛋白表觀黏度ηa和剪切速率γ之間的關(guān)系，各組肌球蛋白樣品特征參數(shù)n均小于1，呈現(xiàn)出剪切稀化現(xiàn)象。NFB組和CaCl2組肌球蛋白表觀黏度增加，NFB和CaCl2的添加增強(qiáng)了肌球蛋白分子間的相互作用，而MFB因其釋放的鈣離子濃度較低，且顆粒較大，使蛋白質(zhì)分子間相互作用程度降低，產(chǎn)生相反的效果。進(jìn)一步結(jié)合動態(tài)流變學(xué)結(jié)果及蛋白質(zhì)分子間作用和構(gòu)象變化發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白分子間二硫鍵的生成及疏水相互作用的發(fā)生與鈣源釋放的鈣離子濃度密切相關(guān)，NFB和CaCl2在加熱過程中釋放的大量鈣離子促進(jìn)了肌球蛋白分子間生成二硫鍵，疏水相互作用增強(qiáng)，肌球蛋白聚集程度升高。NFB對肌球蛋白凝膠性能的促進(jìn)作用與CaCl2相近，明顯優(yōu)于MFB。綜上，NFB的加入能夠增強(qiáng)肌球蛋白的凝膠性能，這可為將NFB作為一種天然安全低價的鈣源應(yīng)用于魚糜制品中提供一定的理論依據(jù)。