苯乳酸和醋酸聯用對大腸桿菌的抑菌機理

寧亞維，付浴男，何建卓，侯琳琳，王志新，肖 香，王世杰，賈英民

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.北京工商大學食品與健康學院，北京 100048；3.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013）

大腸桿菌是食品中常見的食源性致病菌，常通過污染肉、奶、蔬菜等食品導致人體感染[1-2]，會引起嘔吐、輕度發燒、腸道感染、腹瀉等[3]。美國疾病預防控制中心調查數據顯示，每年因食源性致病菌污染的食品導致約有1/6的美國人患病，至少3 000 人死亡[4]；致病性大腸桿菌每年導致約2 100 病例[1]。因此，控制大腸桿菌在食品中的污染具有重要意義。

苯乳酸即2-羥基-3苯基丙酸，又名β-苯基乳酸和3-苯基乳酸，是近年來發現的一種天然有機酸。該物質最先在麥盧卡蜂蜜中發現[5]，而后陸續在多種發酵食品（如面團、乳酸菌發酵產物、泡菜等）中發現[6-7]。苯乳酸具有廣譜抑菌作用[8]，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、腸球菌以及沙門氏菌等均具有抑菌活性[7,9]。另外，苯乳酸具有無毒、穩定性高、親水性好等特點，因此在食品防腐中具有一定的應用潛力。Dieuleveux等[10]發現苯乳酸能明顯抑制牛奶、干酪中單增李斯特菌的生長。Lavermicocca等[11]發現苯乳酸對面包、焙烤制品中的真菌有很好的抑菌效果。Schnürer等[12]將苯乳酸與乳酸菌代謝產物聯合使用在面包上，能使霉菌黑曲霉的生長開始延遲7 d。趙珊等[13]發現6 g/L苯乳酸與5 g/L甘油、5 g/L黃原膠、12 g/L海藻酸鈉制成保鮮劑涂膜低溫保鮮甜櫻桃，可延長其保存期，降低櫻桃的腐爛率、質量損失率。此外，將苯乳酸和抗菌素制成粉劑添加到香腸中，香腸在12 ℃下至少可以保存60 d[14]。

近年來，苯乳酸的抑菌機理研究受到人們關注。Dieuleveux等[15]通過掃描電子顯微鏡觀察結果提出苯乳酸的抑菌靶位為細胞壁；Ning Yawei等[16]通過研究苯乳酸對單核細胞增生李斯特氏菌和大腸桿菌的影響，發現苯乳酸具有細胞膜和DNA雙重抑菌靶位；Str?m等[17]研究了苯乳酸對絲狀真菌蛋白的影響，發現苯乳酸作用位點為苯丙酸脫氫酶；Liu Fang等[18]研究了苯乳酸對陰溝腸桿菌生物膜形成的影響，表明苯乳酸會破壞細胞膜，導致細胞內成分的滲漏及抑制生物膜形成；Chifiriuc等[19]通過革蘭氏陽性菌和陰性菌細胞間細菌通訊的實驗模型證明了苯乳酸干擾細胞生物膜形成過程中毒力因子表達，說明了苯乳酸干擾細胞間的群體感應效應介導的生物過程。上述研究均為苯乳酸單獨抑菌研究，而苯乳酸與其他抑菌物質聯用抑菌機制研究目前鮮有報道。

課題組前期研究發現食品體系中存在醋酸時苯乳酸的防腐效果增加。醋酸可以作為酸度調節劑用于多種食品，如發酵乳制品、發酵面制品、多種飲料、蜂蜜酒等（GB 1886.10—2015《食品安全國家標準 食品添加劑 冰乙酸（又名冰醋酸）》），且多項研究表明其具有抑菌活性，如Nagoba等[20]發現醋酸對銅綠假單胞菌引起的傷口感染具有治療作用；楊轉琴等[21]發現食醋（總酸質量濃度≥3.5 g/100 mL醋酸）對大腸桿菌具有抑制作用；Olaimat等[22]發現醋酸可有效減少芝麻醬或芝麻醬產品中的金黃色葡萄球菌數量。因此，將苯乳酸與醋酸復配用于食品防腐具有較好地應用前景。然而，苯乳酸與醋酸的協同抑菌效應及機理尚不明確。因此，本研究以大腸桿菌為指示菌，從細胞膜、蛋白質、DNA等方面初步探討苯乳酸與醋酸的聯合抑菌效應及機制，為苯乳酸在食品體系的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coliATCC 44752）由河北科技大學食品生物技術與安全實驗室保藏。

苯乳酸、DiSC3(5) 美國Sigma公司；LIVE/DEAD試劑盒 美國Thermo Fisher Scientific公司；TIANamp Bacteria DNA Kit（細菌基因組DNA提取試劑盒）日本Takara Bio公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SZ90激光粒度分析儀 英國Malvern公司；F-7000-FL 2 2 0 熒光分光光度計、S-4 8 0 0-I 掃描電子顯微鏡日本日立公司；Accuri C6 Plus流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；BX53熒光顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；Evolution 220紫外分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；Gel DocTMXR+凝膠成像系統美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 最小抑菌濃度及聯合抑菌指數的測定

采用二倍稀釋法考察了苯乳酸和醋酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。用新鮮的營養肉湯調整培養至對數期的大腸桿菌濃度至1×106CFU/mL備用。在96 孔板中加入苯乳酸使其質量濃度范圍分別為10～0.039 mg/mL，醋酸質量濃度范圍為8～0.016 mg/mL，之后加入100 μL菌液。陽性對照組不加抑菌劑，只加100 μL營養肉湯及100 μL菌液；陰性對照組只加200 μL營養肉湯。于37 ℃恒溫培養箱培養24 h后通過酶標儀測定吸光度，以細菌被抑制的最低抑菌劑質量濃度作為MIC。

根據Liu Fang等[23]的方法測定苯乳酸與醋酸聯合抑菌指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）。制備質量濃度范圍為1/8 MIC～4 MIC的苯乳酸和醋酸二倍稀釋菌液備用。然后，在水平方向將苯乳酸注入到96 孔板中，在垂直方向上將醋酸注入到96 孔板中。之后，在每個孔中注入100 μL濃度為106CFU/mL大腸桿菌細菌懸液并使之與抑菌劑混勻，使每個孔中包含兩種質量濃度的抑菌劑組合，以不含任何抗菌劑的孔用作陽性對照，并在37 ℃下培養24 h后按式（1）～（3）計算FICI。

1.3.2 時間-殺菌曲線的繪制

在營養肉湯中將大腸桿菌培養至對數期，用營養肉湯調節菌懸液濃度為106CFU/mL，加入不同質量濃度的苯乳酸、醋酸，以兩者的終質量濃度將實驗分為5 組，即0.3125 mg/mL（1/4 MIC）苯乳酸、1.25 mg/mL（MIC）苯乳酸、0.25 mg/mL（1/2 MIC）醋酸、0.5 mg/mL（MIC）醋酸、0.312 5 mg/mL（1/4 MIC）苯乳酸+0.25 mg/mL（1/2 MIC）醋酸，未做任何處理的為空白對照組。將上述菌懸液于37 ℃培養一定時間后，采用平板計數法進行活菌數測定。

1.3.3 Zeta電位的測定

參考Sorrentino等[24]的方法，采用激光粒度儀測定苯乳酸、醋酸對大腸桿菌Zeta電位的影響。將培養至對數生長期的大腸桿菌清洗并重懸于無菌超純水中，調節菌體濃度為OD600nm＝0.2。將大腸桿菌與不同抑菌劑作用1 h。之后，用Zeta電位儀進行電位檢測。超純水處理組用作空白組，pH 3的鹽酸處理用作陽性對照。

1.3.4 大腸桿菌細胞膜電勢的測定

苯乳酸與醋酸聯合處理后大腸桿菌細胞膜電勢的測定參考Yang Xu等[25]的方法并做適當修改。取培養至對數期生長期的大腸桿菌，用5 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液（pH 7.2～7.4，含10 mmol/L葡萄糖）清洗重懸至OD600nm＝0.2。將溶于二甲基亞砜的DiSC3(5)加入到細胞懸液中（DiSC3(5)終濃度為1 μmol/L）于30 ℃避光條件下標記15 min，之后將氯化鉀添加到細胞懸液中，使其終濃度為100 mmol/L。然后，將菌懸液與不同質量濃度抑菌劑混勻，以不加抑菌劑的組別為空白對照組，用熒光分光光度計測定熒光強度，激發波長λex＝650 nm、發射波長λem＝672 nm。

1.3.5 細胞膜完整性的測定

將培養至對數生長期的大腸桿菌清洗重懸于質量分數0.85%生理鹽水中并調節至OD600nm＝0.2。將等體積的菌懸液分別與等體積的抑菌劑混合，使抑菌劑達不同質量濃度，并在37 ℃作用1 h；以生理鹽水作陰性對照、體積分數70%異丙醇作陽性對照。之后，將處理的樣品離心、清洗、重懸后在黑暗條件下用2 μmol/L SYTO 9和12 μmol/L碘化丙啶（propidium iodide，PI）標記15 min，用Accuri C6 Plus流式細胞儀對細胞膜完整性進行定量分析，用熒光顯微鏡進行定性分析觀察。

1.3.6 細胞形態的觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察大腸桿菌細胞形態的變化。將培養至對數生長期的大腸桿菌清洗重懸于質量分數0.85%生理鹽水中并調節至OD600nm＝0.2。將等體積的菌懸液分別與等體積的不同質量濃度抑菌劑作用，未經抑菌劑處理的為空白對照組，之后收集菌體并用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）清洗兩次，在4 ℃下用體積分數2.5%戊二醛固定過夜。樣品經0.1 mol/L PBS清洗除去戊二醛，再用不同體積分數乙醇溶液（30%、50%、70%、85%、90%、100%、100%）進行梯度逐級脫水，干燥、噴金后用掃描電子顯微鏡觀察細菌細胞形態。

1.3.7 大腸桿菌蛋白組成的測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）考察了苯乳酸與醋酸對大腸桿菌蛋白質的影響。將培養至對數生長期的大腸桿菌清洗重懸于質量分數0.85%生理鹽水中并調節至OD600nm＝0.2。將等體積的菌懸液分別與等體積的不同質量濃度抑菌劑作用1 h后，4 700×g離心、清洗、收集菌體后按照說明書進行預處理后的4×蛋白上樣緩沖液處理樣品，進行菌體蛋白質的SDS-PAGE。在濃縮膠部分調整電壓為80 V，進入分離膠后調整電壓為120 V，條帶移至膠底后進行脫色，凝膠成像儀拍照記錄結果。

1.3.8 大腸桿菌菌體基因組DNA的測定

采用熒光光譜法考察苯乳酸和醋酸對大腸桿菌基因組DNA的影響。收集對數生長期的大腸桿菌，采用TIANamp Bacteria DNA Kit并按該試劑盒說明書提取細菌基因組，經Evolution 220紫外分光光度計測定DNA的質量濃度為63 μg/mL，純度OD260nm/OD280nm＝1.88。之后，將終質量濃度為7.9 μg/mL的DNA與不同抑菌劑混合作用30 min后使用F-7000-FL 220熒光分光光度計在激發波長280 nm、發射波長300～500 nm下測定混合物的熒光光譜。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均重復3 次取其平均值。采用Origin 2018軟件通過單因素方差分析法對實驗結果進行統計分析并作圖，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 苯乳酸和醋酸對大腸桿菌的抑菌活性

苯乳酸、醋酸對大腸桿菌的MIC分別為1.25、0.5 mg/mL，FICI為0.5，表明苯乳酸和醋酸對大腸桿菌具有協同抑菌效應。根據微量棋盤法的實驗結果，選取不同質量濃度苯乳酸、醋酸及其聯用使用，并通過時間-殺菌曲線（圖1）進一步考察苯乳酸和乳酸聯用的抑菌效果。結果顯示，1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸處理大腸桿菌24 h后，菌落數與未添加抑菌劑的空白對照組在24 h后幾乎達到相同的抑菌效果；而1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸組處理大腸桿菌24 h后菌落數較處理前下降0.76（lg（CFU/mL）），呈現較理想的抑菌效果，與MIC苯乳酸（下降1.11（lg（CFU/mL））、MIC醋酸（下降0.47（lg（CFU/mL））抑菌效果相似。表明1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸單獨使用時24 h內不能抑制菌體的生長，而1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸聯合使用時能達到單一抑菌劑MIC劑量效果，且兩者聯用組菌落數比單一抑菌劑處理組低2（lg（CFU/mL））以上，表明苯乳酸與醋酸對大腸桿菌的抑制具有較好的協同效應[26]。

圖1 苯乳酸和醋酸對大腸桿菌的時間-殺菌曲線Fig.1 Time-killing curves of E.coli treated by phenyllactic acid and/or acetic acid

2.2 苯乳酸和醋酸對大腸桿菌Zeta電位的影響

圖2 苯乳酸和醋酸對大腸桿菌Zeta電位的影響Fig.2 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on zeta potential of E.coil

Zeta電位是對顆粒之間相互排斥或吸引力強度的度量[27]，可反映出細菌表面凈電荷分布情況。從圖2可以看出，空白組Zeta電位為負，可能是由于細胞壁成分上羧基、羥基、氨基、磷酸鹽等陰離子作用導致的[27-28]。經測得，MIC苯乳酸、MIC醋酸、1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸的pH值分別為2.99、3.43、3.28，故選用pH 3的鹽酸作為陽性對照組觀察是否是酸的作用引起Zeta電位變化。經過MIC苯乳酸、MIC醋酸、1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸、鹽酸（pH 3）處理后，Zeta電位分別為3.20、1.71、1.16、1.27 mV，各處理組和空白組相比Zeta電位變化顯著（P＜0.05），而處理組之間的Zeta電位沒有顯著差異（P＞0.05），表明苯乳酸、醋酸處理導致大腸桿菌Zeta電位的變化可能是由于溶液pH值影響細菌表面的官能團的電離，從而影響細菌表面電荷的分布情況。因此推測，苯乳酸與醋酸可以改變菌體細胞的表面電荷特性。

2.3 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌膜電勢的影響

圖3 苯乳酸和醋酸對大腸桿菌膜電勢的影響Fig.3 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on membrane potential of E.coil

為了明確苯乳酸與醋酸對大腸桿菌跨膜電勢的影響，采用膜電位敏感性熒光探針DiSC3(5)考察了苯乳酸與醋酸對大腸桿菌膜電勢的影響。從圖3可以看出，每個實驗組均導致了DiSC3(5)熒光強度的增加，經過1/4 MIC苯乳酸、MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸、MIC醋酸、1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸處理后，DiSC3(5)熒光強度分別增加至151.8、160.9、187.2、199.9、176.6，表明無論是苯乳酸還是醋酸均能消散大腸桿菌膜電勢，且醋酸對大腸桿菌膜電勢的消散能力強于苯乳酸。此外，1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸對大腸桿菌膜消散能力強于MIC苯乳酸，說明1/4 MIC苯乳酸和1/2 MIC醋酸聯用后能增強苯乳酸對大腸桿菌的細胞質膜的破壞作用從而發揮抑菌作用。與Lavermicocca等[11]發現苯乳酸在與有機酸共存時其抑菌活性增強的結果一致。

2.4 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌細胞膜完整性的影響

圖4 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌細胞膜完整性影響的流式細胞圖Fig.4 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on cell membrane integrity of E.coil determined by flow cytometry

采用流式細胞儀（圖4）及熒光顯微鏡（圖5）考察了苯乳酸與醋酸對大腸桿菌細胞膜完整性的影響，采用PI和SYTO 9標記細胞。SYTO 9熒光探針可以標記所有細菌，PI探針僅能標記細胞膜受損細菌。未做任何處理的細胞僅有0.9%被PI沾染（圖4A），熒光顯微鏡結果同樣只觀察到綠色細胞，未觀察到紅色細胞（圖5A）；MIC苯乳酸、MIC醋酸處理大腸桿菌1 h后，PI沾染率分別為15.5%、3.9%（圖4C、E），且從熒光顯微鏡結果觀察發現大部分細胞都發出綠色熒光（圖5C、E），表明苯乳酸、醋酸對大腸桿菌的細胞膜損傷率極低；此外，單一組分的1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸處理的大腸桿菌PI沾染率分別為8.8%、1.6%，而1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸處理組大腸桿菌的PI沾染率為12.8%，明顯高于二者單獨使用（圖4B、D、F）；圖5B、D、F同樣顯示1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸處理組發出紅色熒光的細胞多于1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸處理組，表明苯乳酸和醋酸聯用對細胞膜具有協同破壞性。同時發現，盡管苯乳酸與醋酸聯用可以破壞大腸桿菌細胞膜，但是PI沾染率低于13%，表明兩種有機酸聯用破壞了大腸桿菌細胞膜滲透性而對完整性的損傷較小。關于苯乳酸對細胞膜的損傷研究，Liu Fang等[18]利用熒光探針cFDA和PI觀察到10 mg/100 mL苯乳酸對陰溝腸桿菌細胞膜完整性造成了嚴重損害。本研究中發現苯乳酸對大腸桿菌細胞膜完整性損傷較小，一方面可能由于所用指示菌的差異性；另一方面可能是苯乳酸所用質量濃度差異導致，本研究中苯乳酸MIC僅為1.25 mg/mL，為Liu Fang等所使用的質量濃度的1/8。

圖5 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌細胞膜完整性影響的熒光顯微鏡圖Fig.5 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on cell membrane integrity of E.coil observed by fluorescence microscopy

2.5 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌細胞形態的影響

圖6 掃描電子顯微鏡觀察苯乳酸與醋酸對大腸桿菌超微結構的影響Fig.6 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on cell ultrastructure of E.coil observed by scanning electron microscopy

從圖6可以看出，空白對照組大腸桿菌細胞顯示規則的桿狀形態，細胞大小分布均勻；MIC苯乳酸、MIC醋酸處理大腸桿菌后，菌體均發生凹陷等變形現象，個別菌體出現胞內物質泄漏，細胞發生黏連現象（圖6C、E）。1/4 MIC苯乳酸、1/2 MIC醋酸以及1/4 MIC苯乳酸+1/2 MIC醋酸處理大腸桿菌后，大腸桿菌菌體表面變粗糙，出現輕微變形（圖6B、D、F）。結果表明苯乳酸與醋酸聯用對大腸桿菌的細胞壁和膜完整性無明顯損傷，這與Dieuleveux等[15]報道的苯乳酸對單細胞增生李斯特菌產生損傷結果不同，即苯乳酸可以破壞單細胞增生李斯特菌的細胞壁，使其失去剛性，細胞崩解。上述結果與流式細胞術及熒光顯微鏡結果一致，因此推測苯乳酸和醋酸對大腸桿菌的破壞作用可能由于抑菌劑能透過細胞膜進入細胞而對細胞內部產生作用從而導致菌體變形、局部破裂而產生抑菌作用。

2.6 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌蛋白質的影響

圖7 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌蛋白質影響的SDS-PAGE圖Fig.7 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on protein profile of E.coil evaluated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

蛋白質是參與生命活動的大分子物質，與新陳代謝、電子傳遞等各種生理活動密切相關。擾亂或阻斷蛋白質的合成從而達到抑菌作用是抑菌物質的作用方式之一[29-31]。因此，通過SDS-PAGE考察苯乳酸與醋酸處理對大腸桿菌蛋白質的影響。如圖7所示，僅在分子質量43 kDa處，泳道2～7相對于泳道1處發生條帶減弱消失的現象，其他條帶均無明顯變化，說明苯乳酸、醋酸及二者聯用對蛋白質表達無明顯影響。Str?m等[17]通過雙向電泳研究了苯乳酸對絲狀真菌蛋白質的影響，發現當20 mmol/L苯乳酸作用于絲狀真菌Aspergillus nidulans時，苯乳酸改變了蛋白質的表達，并推測作用位點是苯丙酸脫氫酶。苯乳酸對大腸桿菌和絲狀真菌的蛋白表達影響不一樣可能是由于苯乳酸質量濃度差異或者細菌、真菌的基因表達不同。

2.7 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌基因組DNA的影響

圖8 苯乳酸與醋酸對大腸桿菌DNA影響的熒光光譜圖Fig.8 Effect of phenyllactic acid and/or acetic acid on genomic DNA of E.coil

DNA是生物體內重要的遺傳物質，DNA的損傷會影響遺傳信息的表達，導致代謝合成過程的紊亂，最終導致細胞死亡。因此采用了熒光光譜法考察DNA與抑菌劑的相互作用。從圖8可以看出，經苯乳酸、醋酸處理后，大腸桿菌DNA熒光發生猝滅，且隨著質量濃度的增加猝滅程度加重，即抑菌劑作用后，大腸桿菌的DNA含量降低，表明苯乳酸、醋酸破壞DNA結構，導致DNA泄漏或者干擾DNA的正常合成代謝從而抑制大腸桿菌。Liu Fang等[18]通過紫外吸收測試，發現低質量濃度（1 mg/mL）的苯乳酸僅引起小分子物質如ATP的泄漏，高質量濃度苯乳酸引起小分子物質泄漏的同時還會導致大分子物質如核酸、蛋白質的泄漏。此外，有機酸還可通過干擾甚至阻斷DNA的合成，插入DNA雙螺旋中的凹槽，影響復制、轉錄和表達等以發揮抑菌作用[32-33]。

3 討 論

苯乳酸作為一種天然抑菌劑，由于其無毒、抑菌譜廣而受到人們的關注，且抑菌劑聯用可有效提高抗菌活性，減少抑菌劑的使用。前期研究[11]發現乳酸、醋酸存在下，可使苯乳酸抑真菌活性分別提高30%、18%。苯乳酸與苯甲酸鈉、山梨酸鉀聯用對大腸桿菌具有協同抑菌作用，且苯乳酸使用劑量能降低75%[34]。乳酸鈉和Nisin聯合使用能顯著增強乳酸鈉對布氏曲霉的抑菌作用[35]。本實驗中苯乳酸與醋酸聯用對大腸桿菌具有協同抑菌作用，1/2 MIC苯乳酸和1/4 MIC醋酸即可達到單一抑菌劑質量濃度為MIC時的抑菌效果，苯乳酸和醋酸的使用量分別降低了50%和75%。此外，苯乳酸、醋酸在食品可同時發揮抑菌、酸度調節劑的作用，因此在食品體系中具有潛在應用價值。

目前，關于苯乳酸的單一抑菌機理報道較多，主要集中在細胞壁、細胞膜、蛋白質、DNA等作用靶位[15-18]。本研究發現苯乳酸、醋酸作用于大腸桿菌，均可改變其細胞Zeta電位、細胞膜電勢，但對細胞膜完整性損傷較少，表明苯乳酸和醋酸主要通過改變細胞膜滲透性但不明顯改變其完整性而發揮抑菌作用，苯乳酸和醋酸對蛋白質沒有明顯影響，可能是抑菌物質的質量濃度還沒達到引起大分子物質泄漏的水平。

綜上所述，推測苯乳酸和醋酸對大腸桿菌的抑菌作用通過透過大腸桿菌細胞膜，輕微破壞大腸桿菌細胞膜完整性，影響Zeta電位、膜電勢，進入大腸桿菌細胞內與DNA發揮作用，擾亂其正常生理代謝從而導致大腸桿菌的死亡達到抑菌目的。