減鹽對東北農家醬中生物胺形成的影響

解雙瑜，孫 波,*，劉 麗，李天一，叢 霞

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省藥品檢驗研究中心，黑龍江 哈爾濱 150001）

東北農家醬作為中國北方歷史悠久的傳統大豆發酵制品因其獨特的風味深受人們的喜愛。其中食鹽雖為發酵輔料但卻起著不可或缺的重要作用，對產品的感官風味、貨架期甚至食品安全性都有非常重要的影響[1-2]。在其發酵過程中食鹽添加量一般控制在12%左右甚至更高，這主要是因為高含量的食鹽可以有效地抑制不良微生物的增殖與代謝。然而，近年來國內外許多學者的研究都表明人類日常飲食中長期過量攝入食鹽會導致高血壓、心腦血管等疾病[3-4]的發生。世界衛生組織則建議，每人每天食鹽攝入量應不高于5 g[5]。我國從2018年起也首次推出了《中國食品工業減鹽指南》，為食品加工提供減鹽技術指導建議、路線和措施。總之，減鹽已成為世界各國未來食品工業發展的必然趨勢之一[6]。東北農家醬作為高鹽食品，采取減鹽措施也勢在必行，但是進行減鹽處理很有可能導致其發酵過程中微生物菌系發生變化[7-8]，以及如生物胺等一些不良代謝產物的形成與過量積累[9-13]。

生物胺是一類具有生物活性的含氮有機小分子化合物[14]，其中最常見的生物胺包括精胺、腐胺、色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺等。雖然人類機體在正常生理代謝活動中需要一定量的生物胺[15-16]，但是生物胺過量積累會對人體產生毒性[17-19]，其中以組胺的毒性最強[20-21]。生物胺在大豆發酵制品[22-24]、腌制魚以及肉制品[25]等發酵食品中[26-28]廣泛存在，是影響其食品安全性的重要因素之一。目前世界各國關于食品中生物胺的限量標準均不同。其中歐盟委員會建議食品中組胺含量不應超過100 mg/kg[29]。綜上所述，有關食鹽對東北農家醬中生物胺形成影響的研究工作意義重大。

基于此，本實驗通過研究不同食鹽添加量對東北農家醬中生物胺含量、理化指標、微生物指標以及感官品質的影響，以期在控制生物胺代謝過量積累的前提下盡可能減少食鹽添加量，并最終為減鹽東北農家醬的生產提供一定的技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精胺鹽酸鹽、腐胺鹽酸鹽、色胺、β-苯乙胺、尸胺鹽酸鹽、組胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、亞精胺、1,7-二氨基庚烷 上海世峰生物科技有限公司；丹磺酰氯美國Sigma公司；超純水 杭州娃哈哈集團有限公司；乙腈、丙酮、乙酸銨、乙酸均為色譜純；碳酸氫鈉、氨水、氫氧化鈉、甲醛均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀（配有SPD-20A紫外檢測器、Lab Solution工作站） 日本島津公司；LG10-2.4A高速離心機 北京醫用離心機廠；FA2004分析天平上海衡平儀器儀表廠；DH2500A電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；PHS-3E總酸計 上海儀電科學儀器股份有限公司；超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司。

1.3 方法

1.3.1 減鹽東北農家醬的樣品制備與采集

1.3.1.1 東北農家醬的生產工藝流程

大豆→除雜→浸泡→蒸豆→卡塊→制曲→曲塊入醬缸→加鹽水→發酵→打耙、曬醬→灌裝、封袋→成品

1.3.1.2 減鹽東北農家醬樣品制備

將經過篩選的大豆原料進行除雜后稱量，再投入泡豆槽中用清水浸泡約10 h直至豆粒慢慢吸收水分呈無夾心狀態。將已浸泡好的大豆放入旋轉蒸鍋采用加壓蒸煮方式進行蒸豆（蒸汽壓0.15 MPa、時間15 min）。蒸豆結束后將其經輸送機連續輸送至卡塊機，制成40 cm×20 cm×10 cm曲塊并移入曲房進行制曲，制曲時間為60 d。當曲塊完全成熟后按照曲塊、食鹽、水質量比3∶1∶10投料到150 kg的醬缸中作為對照實驗組。同時另取4 個150 kg的醬缸，加入與對照實驗組等量的曲塊和水，僅在對照實驗組的基礎上將食鹽添加量分別減少10%、20%、30%、40%，依次作為減鹽實驗組1、減鹽實驗組2、減鹽實驗組3、減鹽實驗組4，上述5 組均在同一條件下進行發酵，期間充分打耙混合均勻，90 d后發酵結束。

1.3.1.3 減鹽東北農家醬的樣品采集

從上述5 組東北農家醬中分別稱取200 g樣品用于生物胺含量、理化指標、微生物指標測定及感官品質評分。

1.3.2 東北農家醬樣品中生物胺含量的測定

1.3.2.1 標準溶液的配制

分別稱取各標準品（生物胺標準品稱取量分別為：精胺鹽酸鹽17.6 mg、腐胺鹽酸鹽18.7 mg、色胺10.2 mg、β-苯乙胺10.2 mg、尸胺鹽酸鹽17.5 mg、組胺鹽酸鹽16.9 mg、酪胺鹽酸鹽12.9 mg、亞精胺10.3 mg），用0.1 mol/L HCl溶液配制質量濃度為1 000 mg/L的生物胺標準儲備溶液，4 ℃儲存備用。分別取上述溶液，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋，充分混勻，配制成質量濃度為100 mg/L的生物胺標準混合使用液。

1.3.2.2 標準曲線的建立

分別取生物胺標準混合使用液，用0.1 mol/L HCl溶液稀釋，配制成質量濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100.0 mg/L的生物胺標準系列溶液。

1.3.2.3 樣品預處理

準確稱取東北農家醬10.0 g，加入500 μL 1,7-二氨基庚烷（1.0 mg/mL），混合均勻。加入20 mL質量分數5%的三氯乙酸溶液，混勻，振蕩提取30 min，隨后6 000 r/min離心10 min，轉移上清液至50 mL容量瓶中，殘渣用20 mL質量分數5%三氯乙酸溶液再提取一次，合并上清液，用質量分數5%三氯乙酸溶液定容至刻度。

1.3.2.4 試樣衍生化處理

分別吸取1 mL待衍生的樣品溶液和系列生物胺標準溶液，依次加入200 μL氫氧化鈉溶液（2 mol/L）、3 0 0 μ L 飽和碳酸氫鈉溶液、2 m L 丹磺酰氯溶液（10 mg/mL，溶劑為丙酮），漩渦混勻1 min后置于40 ℃恒溫水浴中衍生45 min，取出，分別加入100 μL的氨水（體積分數25%），于避光處反應30 min，反應結束后經0.22 μm濾膜過濾到進樣小瓶，待測定[30]。

1.3.2.5 色譜條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長254 nm；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL，梯度洗脫條件參考GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》。

1.3.3 東北農家醬理化指標的測定

1.3.3.1 東北農家醬中氨基酸態氮含量的測定

參考GB 5009.235—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》中第一法——酸度計法測定東北農家醬中氨基酸態氮含量。

1.3.3.2 東北農家醬中總酸含量的測定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》測定東北農家醬中總酸含量。

1.3.4 東北農家醬中微生物指標的測定

參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》測定東北農家醬中菌落總數。

1.3.5 東北農家醬感官品質評價

挑選10 名經過訓練后的品評人員，對不同東北農家醬樣品進行滋味、氣味、色澤和體態的品評。具體操作方法如下：稱取50 g樣品，置于白色瓷盤中，觀察其氣味、色澤、體態，并用玻璃棒蘸取，嘗其滋味。每品嘗完一個樣品后，用清水漱口，再進行下一個樣品的品嘗，具體評分標準見表1。

表1 東北農家醬感官品質評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of farmhouse fermented soybean paste in northeast China

1.4 數據統計與處理

每個實驗獨立重復3 次，數據采用Excel軟件處理，結果以平均值±標準差表示，圖表采用Origin 8.0軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 減鹽對東北農家醬生物胺形成的影響

2.1.1 生物胺圖譜與標準曲線

2.1.1.1 生物胺圖譜

圖1 8 種生物胺標準品衍生物混合色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed derivatives of 8 biogenic amine standards

從圖1可以看出，整個梯度洗脫結束時間為37 min，在該時間內所有生物胺衍生物被全部洗脫出，且各生物胺衍生物分離效果好，峰形對稱，無雜質干擾，表明該流動相梯度是可行的。8 種單一生物胺衍生物分析結束后，確定混合標準溶液8 種生物胺衍生物的出峰順序為：精胺、腐胺、色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺。

2.1.1.2 生物胺標準曲線

以系列標準溶液的質量為縱坐標，以8 種生物胺和內標的峰面積比為橫坐標，繪制標準曲線。如表2所示，8 種生物胺在1～100 mg/L范圍內線性良好，決定系數R2≥0.999，可以滿足生物胺測定的要求。

表2 8 種生物胺的保留時間、回歸方程和決定系數Table 2 Retention times, calibration equations and coefficient of determination of 8 biogenic amines

2.1.2 減鹽東北農家醬中生物胺含量變化

如圖2所示，對照實驗組的總胺及精胺、腐胺、色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺含量分別為253.84、92.71、7.09、8.84、19.04、36.90、47.04、40.91、1.31 mg/kg。與對照實驗組相比，減鹽實驗組1中腐胺含量增加至13.93 mg/kg，總胺及其他種類胺含量無明顯變化；減鹽實驗組2中總胺及苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺含量分別增加至341.64、30.12、68.59、64.32、47.98 mg/kg，其他種類胺含量無明顯變化；減鹽實驗組3及減鹽實驗組4中總胺及腐胺、色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺含量均有所增加，其中，總胺含量分別增加至382.31、419.68 mg/kg，腐胺含量分別增加至15.54、15.73 mg/kg，色胺含量分別增加至11.76、11.94 mg/kg，苯乙胺含量分別增加至29.13、28.46 mg/kg，尸胺含量分別增加至74.20、111.57 mg/kg，組胺含量分別增加至103.46、107.42 mg/kg，酪胺含量分別增加至51.05、48.51 mg/kg，其他種類胺含量無明顯變化。

2.2 減鹽對東北農家醬理化指標的影響

圖2 減鹽對東北農家醬生物胺形成的影響Fig.2 Effect of salt reduction on biogenic amine formation in farmhouse fermented soybean paste in northeast China

如圖3、4所示，對照實驗組的氨基酸態氮、總酸含量分別為1.03、1.37 g/100 g。與對照實驗組相比，減鹽實驗組1中氨基酸態氮與總酸含量均無明顯變化；減鹽實驗組2、減鹽實驗組3、減鹽實驗組4中，總酸含量均有所增加，分別增加至1.85、2.01、2.34 g/100 g，氨基酸態氮含量無明顯變化。

圖3 減鹽對東北農家醬氨基酸態氮含量的影響Fig.3 Effect of salt reduction on amino nitrogen content in farmhouse fermented soybean paste in northeast China

圖4 減鹽對東北農家醬總酸含量的影響Fig.4 Effect of salt reduction on acidity in farmhouse fermented soybean paste in northeast China

2.3 減鹽對東北農家醬微生物指標的影響

圖5 減鹽對東北農家醬菌落總數的影響Fig.5 Effect of salt reduction on total number of colonies in farmhouse fermented soybean paste in northeast China

如圖5 所示， 對照實驗組的菌落總數為7.6（lg（CFU/g））。與對照實驗組相比，減鹽實驗組1、減鹽實驗組2中菌落總數均無明顯變化；減鹽實驗組3、減鹽實驗組4中菌落總數有所增加，分別增加至9.2、9.4（lg（CFU/g））。

2.4 減鹽對東北農家醬感官品質的影響

圖6 減鹽對東北農家醬感官品質的影響Fig.6 Effect of salt reduction on sensory evaluation score of farmhouse fermented soybean paste in northeast China

如圖6所示，對照實驗組的滋味、氣味、色澤、體態評分及總分分別為32.6、28.3、18.6、9.3、88.8 分。與對照實驗組相比，減鹽實驗組1中滋味、氣味、色澤、體態評分及總分均無明顯變化，減鹽實驗組2中滋味評分及總分有所升高，其中滋味評分升高至36.3 分，總分升高至92.6 分，氣味、色澤、體態評分無明顯變化；減鹽實驗組3中，滋味、氣味評分及總分有所降低，其中滋味評分降低至30.7 分，氣味評分降低至26.7 分，總分降低至85.6 分；減鹽實驗組4中，滋味、氣味評分及總分有所降低，其中滋味評分降低至28.5 分，氣味評分降低至24.5 分，總分降低至80.0 分。

3 結 論

與對照實驗組相比，減鹽實驗組隨著食鹽添加量的減少除精胺與亞精胺外，其總胺與其他生物胺的含量均有不同程度的增加，且尸胺與組胺含量的增加最為明顯。同時總酸含量、菌落總數及感官品質評分均有不同程度的變化；而氨基酸態氮含量則無明顯變化。

總之，減鹽對東北農家醬中生物胺形成以及理化指標、微生物指標和感官品質均有一定程度的影響。其中，食鹽添加量減少20%以下的減鹽實驗組與對照實驗組相比其組胺含量并無明顯增加，其組胺含量低于歐盟委員會的建議限量（100 mg/kg）。此外，食鹽添加量減少20%以下的減鹽實驗組其東北農家醬理化指標、微生物指標也無明顯變化，感官品質評分有所增加。因此，綜合考慮減鹽東北農家醬生產時其食鹽添加量在正常食鹽添加量的基礎上減少20%左右時比較適宜。