桑葉生物堿對肝纖維化小鼠的改善作用及機制

王祖文，沈以紅，黃先智，丁曉雯,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏重點實驗室，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶 400716；2.西南大學 家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 北碚 400716）

肝纖維化是多種慢性肝病轉(zhuǎn)化為肝硬化的中間過程，其主要特征是肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活、肝細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積[1-2]。肝纖維化發(fā)生過程受多條信號傳導(dǎo)通路控制，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是主要的促纖維化細胞因子，TGF-β1/Smads通路是激活HSC促進ECM生成的主要途徑[3-4]。而ECM的合成與降解平衡受基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）的控制，MMP蛋白促進ECM降解，TIMP蛋白通過抑制MMP的活性進而抑制ECM降解[5]。TGF-β1的過表達可抑制MMPs表達，促進TIMPs表達，進而導(dǎo)致ECM沉積，加劇肝纖維的形成[6]。因此調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路以及TIMPs/MMPs的表達對逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有重要作用[7-8]。

桑葉生物堿是桑葉的特征活性成分之一，可降糖降脂[9-10]、抗機體大分子氧化損傷[11-12]、改善高脂飲食誘導(dǎo)的肝損傷[13]等。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)50、100、200 mg/kgmb劑量的桑葉生物堿均能在不同程度上降低肝纖維化模型小鼠血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、肝纖維標志物透明質(zhì)酸（hyaluronicacid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、IV型膠原蛋白（collagen IV，Col IV）、III型前膠原（type III precollagen，PC-III）等指標水平，降低機體炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，對肝纖維化具有改善作用[14]。因此，本研究擬通過建立CCl4聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，觀察桑葉生物堿對TGF-β1/Smads通路相關(guān)信號分子及MMP-13、TIMP-1mRNA相對表達量的影響，進一步探討桑葉生物堿對肝纖維化的改善作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性昆明種小鼠60 只（4 周齡），體質(zhì)量（20±2）g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2018-0003。基礎(chǔ)飼料，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心；高脂飼料，實驗室自制。配方：基礎(chǔ)飼料69.5%（質(zhì)量分數(shù)，下同）、豬油12%、蔗糖10%、蛋黃粉4%、膽固醇4%、膽酸鈉0.5%[13]。

桑葉粉末，重慶畜牧科學院蠶業(yè)研究所提供。桑葉生物堿，實驗室自制[12]。本實驗所制得的桑葉生物堿的總生物堿質(zhì)量分數(shù)為93.57%。

橄欖油、四氯化碳（CCl4）、氯仿 成都市科龍化工試劑廠；水飛薊賓（純度98%） 南京道斯夫生物科技有限公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、I型膠原蛋白（collagen I，Col I）、III型膠原蛋白（collagen III，Col III） 上海優(yōu)選生物科技有限公司；高純總RNA快速提取試劑盒（離心柱型）北京百泰克生物技術(shù)有限公司；cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）寶生物工程（大連）有限公司；2×實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）擴增的預(yù)混合溶液（HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix (No Rox)） 上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy H1型酶標儀 美國基因有限公司；T100T型PCR儀 美國Bio-Rad公司；qTOWER3G型qPCR儀德國耶拿公司；NanoDrop ND-2000C型微量紫外分光光度計 美國Thermo公司；ALPAAI-4LSC型高速離心機 德國Christ公司；DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱上海齊欣科學儀器有限公司；5880 R型冷凍離心機德國Eppendorf公司；DW-HL438型超低溫冰箱 合肥美菱股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及處理

本研究獲得西南大學實驗動物保護協(xié)會許可，小鼠按照西南大學實驗動物保護和使用規(guī)則飼養(yǎng)，室溫22～25 ℃，相對濕度40%～60%，12 h明暗交替（9:00至21:00），自由進食飲水。60 只昆明種小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分成正常對照組、模型組、陽性藥物組及桑葉生物堿低、中、高劑量組，各10 只。造模組腹腔注射體積分數(shù)10% CCl4橄欖油溶液（5 mL/kgmb），隔天注射1 次，持續(xù)8 周，并在此期間給予高脂飼料喂養(yǎng)；正常對照組小鼠腹腔注射等量橄欖油溶液，并給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。造模成功判定方法：每組隨機選取2 只小鼠，頜下靜脈取血，測定各組小鼠血漿中ALT、AST活力及肝纖維化4 項指標（HA、LN、PC III、Col IV）水平，若參與造模的小鼠與正常對照組小鼠的同一指標值之間差異具有統(tǒng)計學意義，肝纖維化小鼠肝臟組織病變明顯，膠原沉積，則判定為造模成功。

待造模成功后，低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kgmb桑葉生物堿溶液，陽性藥物組灌胃100 mg/kgmb水飛薊賓溶液，正常對照組和模型組給予等量蒸餾水（10 mL/kgmb），每日1 次，連續(xù)灌胃45 d，同時喂飼基礎(chǔ)飼料。

1.3.2 實驗樣本的獲取與肝組織α-SMA、Col I、Col III水平的測定

灌胃結(jié)束后，將實驗小鼠禁食12 h，斷頸處死，解剖取出肝臟，稱取適量肝組織，加入9 倍體積的生理鹽水，在冰浴中機械勻漿。4 ℃，3 000 r/min離心10 min后取上清液備用。

肝組織α-SMA、Col I、Col III水平測定按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書標示的步驟進行。

1.3.3 熒光實時定量PCR測定肝組織mRNA相對表達量

按照TRIzol試劑盒提取純化操作方法提取肝臟組織總RNA，所得的RNA進行完整性及純度測定。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，再進行PCR擴增。qPCR體系10 μL：SYBR Green I 4.2 μL、上游引物0.3 μL、下游引物0.3 μL、H2O 4.2 μL、cDNA 1 μL。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成，如表1所示。反應(yīng)條件：95 ℃、4 min預(yù)變性；95 ℃、15 s變性，55～60 ℃、30 s退火，共40 個循環(huán)。以β-actin作內(nèi)參基因，分別測定肝組織TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7、TIMP-1、MMP-13mRNA相對表達量，結(jié)果以2-△△Ct表示。

表1 引物序列及產(chǎn)物Table 1 Primer sequences used in this study and length of corresponding amplification products

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果均以平均值±標準差表示，采用SPSS 20.0軟件對結(jié)果進行單因素方差分析，多組平均數(shù)的比較采用Duncan’s法檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。采用Origin 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉生物堿對小鼠血漿ALT、AST活力及肝纖維化4 項指標水平的影響

實驗前期研究證明，CCl4聯(lián)合高脂飲食誘導(dǎo)8 周后，模型組小鼠血漿AST、ALT活力以及肝纖維化4 項指標（HA、LN、PC III、Col IV）水平與正常對照組小鼠相比顯著上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）[14]。在造模成功的基礎(chǔ)上，分別灌胃50、100、200 mg/kgmb劑量的桑葉生物堿45 d，對應(yīng)的低、中、高劑量組小鼠血漿AST、ALT活力和肝纖維化4 項指標水平均得到不同程度改善，與模型組結(jié)果具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），病理學切片結(jié)果也同樣觀察到小鼠肝纖維化狀況得到改善。

2.2 桑葉生物堿對小鼠肝組織α-SMA、Col I及Col III質(zhì)量濃度的影響

表2 桑葉生物堿對小鼠肝組織α-SMA、Col I及Col III質(zhì)量濃度的影響（n＝10）Table 2 Effect of mulberry leaf alkaloid on the contents of α-SMA, Col I and Col III in liver tissue of mice (n= 10)

由表2 可知，與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織α-SMA、Col I及Col III質(zhì)量濃度均顯著升高（P＜0.05），提示HSC被激活，肝組織中ECM沉積，與前期實驗結(jié)果中肝組織病理切片結(jié)果一致（此處略）[14]，表明在CCl4聯(lián)合高脂飲食作用下小鼠表現(xiàn)出肝纖維化。與模型組比，陽性藥物組與桑葉生物堿各劑量組小鼠肝組織α-SMA、Col I及Col III質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)下降趨勢；陽性藥物組小鼠肝組織α-SMA、Col I及Col III質(zhì)量濃度分別下降了15.69%、23.14%、15.03%（P＜0.05），其中Col I質(zhì)量濃度與正常對照組差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），α-SMA、Col III質(zhì)量濃度與正常對照組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；灌胃高劑量桑葉生物堿45 d后，小鼠肝組織α-SMA、Col I及Col III質(zhì)量濃度分別下降了19.55%、19.93%、13.84%（P＜0.05），上述3 個指標與陽性藥物組之間差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但均未恢復(fù)到正常水平。結(jié)果表明，桑葉生物堿可在一定程度上降低HSC的活化程度，減少ECM沉積，但在實驗劑量、時間范圍內(nèi)未能恢復(fù)到正常水平。

2.3 桑葉生物堿對肝纖維小鼠TGF-β1/Smads信號通路的影響

肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中有許多信號通路參與，其中TGF-β1/Smads通路有著很重要的作用。因此探討了桑葉生物堿對該通路相關(guān)信號分子的基因表達的影響。

2.3.1 桑葉生物堿對小鼠肝組織TGF-β1、Smad3mRNA表達的影響

圖1 桑葉生物堿對小鼠肝組織TGF-β1和Smad3 mRNA表達的影響Fig.1 Effect of mulberry leaf alkaloid on the mRNA expression of TGF-β1 and Smad3 in liver tissue of mice

由圖1可知，正常對照組小鼠肝組織TGF-β1和Smad3mRNA相對表達量分別為0.306 0±0.041 2、0.208 7±0.038 3；與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織TGF-β1、Smad3mRNA表達水平分別升高了230.29%、382.80%（P＜0.05）。與模型組比，陽性藥物組和桑葉生物堿各劑量組TGF-β1mRNA表達水平分別降低了58.40%、44.27%、53.28%、59.04%（P＜0.05）；Smad3mRNA表達水平分別降低了64.69%、17.16%、54.43%、56.73%（P＜0.05），但均未恢復(fù)到正常水平。其中，中、高劑量組TGF-β1mRNA表達水平與陽性藥物組間差異不具統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但對Smad3的調(diào)節(jié)效果不如陽性藥物。以上結(jié)果表明，桑葉生物堿可下調(diào)TGF-β1/Smads信號通路中TGF-β1和Smad3mRNA的表達，進而抑制HSC的活化，減少膠原蛋白的生成，但作用效果有限。

2.3.2 桑葉生物堿對小鼠肝組織Smad4和Smad7mRNA表達的影響

圖2 桑葉生物堿對小鼠肝組織Smad4和Smad7 mRNA表達的影響Fig.2 Effect of mulberry leaf alkaloid on the mRNA expression of Smad4 and Smad7 in liver tissue of mice

由圖2 可知，正常對照組小鼠肝組織S m a d 4和Smad7mRNA相對表達量分別為0.359 7±0.034 6、2.540 7±0.366 3；與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織S m a d 4m R N A 表達水平升高了1 7 9.5 6%（P＜0.05），Smad7mRNA表達水平降低了60.35%（P＜0.05）。與模型組比，陽性藥物組和桑葉生物堿各劑量組Smad4mRNA表達水平分別降低了53.60%、34.59%、54.62%、50.70%（P＜0.05），Smad7mRNA表達水平分別升高了9 1.7 6%、3 7.0 8%、4 8.2 9%（P＜0.05），但均未恢復(fù)至正常水平。其中，中、高劑量的桑葉生物堿對Smad4mRNA表達調(diào)節(jié)效果與本實驗劑量的陽性藥物差異不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但對Smad7的調(diào)節(jié)效果不如陽性藥物。以上結(jié)果表明，桑葉生物堿能下調(diào)TGF-β1/Smads信號通路中Smad4基因表達，上調(diào)Smad7的表達，減少或抑制Smad4與磷酸化Smad3復(fù)合物的形成，從而有助于減少膠原蛋白的生成和HSC的活化，但作用效果有限。

2.4 桑葉生物堿對肝纖維小鼠TIMP-1和MMP-13 mRNA表達的影響

正常情況下，ECM的合成與降解處于動態(tài)平衡；當肝臟出現(xiàn)損傷，HSC被激活時，TIMPs表達將上調(diào)，MMPs表達下調(diào)，二者動態(tài)平衡被打破時，ECM沉積，導(dǎo)致肝纖維化的不斷發(fā)展[14]。因此探討了桑葉生物堿是否會影響MMP-13和TIMP-1這兩種酶的表達。由圖3可知，正常對照組小鼠肝組織TIMP-1、MMP-13m R N A 相對表達量分別為0.2 0 2 0±0.0 4 9 6、1.580 8±0.143 8。與正常對照組相比，模型組小鼠肝組織TIMP-1mRNA表達水平升高了396.84%（P＜0.05），MMP-13mRNA表達水平降低了36.50%（P＜0.05）。除低劑量組MMP-13表達量與模型組差異無統(tǒng)計學意義外，其余各組TIMP-1、MMP-13mRNA相對表達量均顯著降低或升高（P＜0.05）。與模型組比，陽性藥物組與桑葉生物堿中、高劑量組TIMP-1mRNA表達水平分別降低了64.91%、41.38%、49.09%（P＜0.05），MMP-13mRNA表達水平分別升高了25.21%、16.00%、25.72%（P＜0.05），但均未恢復(fù)至正常水平。中、高劑量桑葉生物堿對MMP-13mRNA表達的調(diào)節(jié)作用與實驗劑量陽性藥物差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而對TIMP-1的調(diào)節(jié)效果不如陽性藥物。以上結(jié)果表明，桑葉生物堿在一定程度上可調(diào)節(jié)控制ECM合成與降解的酶TIMP-1、MMP-13mRNA表達水平，從而改善小鼠肝纖維化。

圖3 桑葉生物堿對小鼠肝組織TIMP-1和MMP-13 mRNA表達的影響Fig.3 Effect of mulberry leaf alkaloid on the mRNA expression of TIMP-1 and MMP-13 in liver tissue of mice

3 討 論

正常動物體內(nèi)，HSC維持靜止的非纖維化表型，此時ECM由一系列大分子組成，包括膠原蛋白（I、III、IV、V、VI型）以及LN和纖維連結(jié)蛋白在內(nèi)的非膠原糖蛋白和蛋白多糖[16]。當肝臟受到某些因素持續(xù)刺激時，機體內(nèi)大量生成的炎癥因子和氧化應(yīng)激等反應(yīng)會激活HSC轉(zhuǎn)化為具有增殖、遷移、收縮和分泌ECM能力的肌成纖維細胞樣細胞，導(dǎo)致肝纖維化的形成[17-18]。α-SMA是HSC活化的標志物[19]，Col I、III質(zhì)量濃度的增加表明肝臟出現(xiàn)ECM沉積[20]。本實驗肝纖維化模型小鼠肝組織α-SMA、Col I和Col III質(zhì)量濃度顯著上升，說明CCl4聯(lián)合高脂飲食造成小鼠肝HSC細胞被激活，出現(xiàn)ECM沉積，小鼠具有肝纖維化癥狀。在灌胃桑葉生物堿45 d后，肝纖維化小鼠的肝組織中α-SMA、Col I和Col III質(zhì)量濃度顯著降低，說明該實驗劑量下的桑葉生物堿可降低肝纖維小鼠HSC的活化程度、減少肝組織ECM的沉積，有助于肝纖維化的改善。

肝纖維化的形成發(fā)展離不開肝臟中各種細胞生長因子、血管活性因子及脂肪因子的參與，其中TGF-β1是促纖維化中最重要的細胞因子之一，可通過Smad依賴性和非依賴性信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮其生物學和病理學活性，TGF-β1/Smads信號通路作為干預(yù)治療肝纖維化的有效靶點一直備受關(guān)注[21-22]，在TGF-β1/Smads信號通路中，Smads蛋白是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心環(huán)節(jié)，其中受體調(diào)節(jié)型Smad（R-Smad）如Samd2、Samd3蛋白是TGF-β1介導(dǎo)的組織纖維化的兩個主要下游調(diào)節(jié)因子。與Smad2不同，Smad3可與多種促纖維化細胞因子的DNA序列直接結(jié)合，促進纖維化的發(fā)生，因此它可能是纖維化信號傳導(dǎo)過程中的關(guān)鍵因子[6]。而Smad4（通用型Smad）是信號傳遞必須的中心轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，與磷酸化的R-Smad結(jié)合形成復(fù)合物參與信號傳遞；而Smad7（抑制型Smad）是TGF-β1/Smads通路的負反饋調(diào)節(jié)因子，抑制R-Smad與受體的結(jié)合或者磷酸化[23]。當肝臟遭受外界刺激或發(fā)生損傷時，機體會釋放細胞因子TGF-β1，TGF-β1通過與膜上受體結(jié)合，促進Smad3蛋白磷酸化，磷酸化Smad3蛋白與Smad4蛋白結(jié)合，形成的復(fù)合物由細胞質(zhì)進入細胞核，與靶基因啟動子的特定DNA序列結(jié)合，從而調(diào)控ECM的合成、降解和HSC的轉(zhuǎn)化；而Smad7蛋白通過干擾Smad3蛋白的磷酸化反應(yīng)，阻礙TGF-β1通路信號的傳導(dǎo)，從而抑制纖維化的發(fā)展[6,24]。

一些天然活性成分如白屈菜紅堿[25]、槲寄生生物堿[26]、垂盆草總黃酮[27]、黃芪多糖[28]、杜仲多糖[29]均可通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路中相關(guān)基因的表達來抑制HSCs的活化增殖，起到改善肝纖維化的作用。因此本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，進一步探究桑葉生物堿對肝纖維化小鼠肝組織TGF-β1/Smads信號通路的影響。實驗結(jié)果顯示，在CCl4與高脂飲食聯(lián)合因素刺激下小鼠肝組織TGF-β1、Smad3、Smad4mRNA表達上升，而Smad7mRNA表達下降，與眾多研究結(jié)果[25,28,30]一致。在灌胃桑葉生物堿45 d后，桑葉生物堿能顯著下調(diào)肝纖維化小鼠肝組織中TGF-β1、Smad3、Smad4mRNA的表達，上調(diào)Smad7mRNA表達，且中、高劑量的桑葉生物堿對TGF-β1、Smad4mRNA的調(diào)節(jié)結(jié)果與100 mg/kgmb水飛薊賓水溶液效果相當，對Smad3和Smad7的調(diào)節(jié)作用遜于水飛薊賓。雖然肝纖維化小鼠在實驗周期內(nèi)未恢復(fù)正常，但該結(jié)果說明桑葉生物堿能通過調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路相關(guān)基因的表達，抑制HSC的活化，減少ECM的合成。

ECM的合成與降解主要通過MMPs和其特異性抑制劑TIMPs之間的動態(tài)平衡來維持。MMPs和TIMPs是受TGF信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)的靶基因，在機體受到刺激時，細胞因子TGF-β1可促進TIMPs表達，抑制MMPs的活性，減少ECM的降解，加深肝纖維化[31]。MMPs有6 類，其中間質(zhì)膠原酶類MMP-13具有降解ECM中主要成分Col I和Col III的能力[32]；TIMPs有4 類，在肝臟中僅存TIMP-1、TIMP-2，而TIMP-1對絕大對數(shù)的MMPs都有抑制作用[33]。本研究結(jié)果顯示：與正常對照組比，模型組小鼠肝組織TIMP-1mRNA表達上升，MMP-13mRNA表達下降，與安禎祥[34]、姜輝[35]等的研究結(jié)果一致。在灌胃桑葉生物堿45 d后，桑葉生物堿能顯著下調(diào)肝纖維化小鼠機體中TIMP-1mRNA的表達，上調(diào)MMP-13mRNA的表達，且中、高劑量對MMP-13mRNA表達的調(diào)節(jié)作用與100 mg/kg水飛薊賓溶液相當，對TIMP-1的調(diào)節(jié)作用遜于水飛薊賓。該結(jié)果說明桑葉生物堿可能通過調(diào)節(jié)MMP-13、TIMP-1基因表達，促進Col I和Col III的降解，減輕小鼠肝纖維化。

綜上，桑葉生物堿通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制HSC的活化，從而減少ECM的生成，還可以通過下調(diào)TIMP-1、上調(diào)MMP-13基因表達來促進ECM的降解，達到改善肝纖維化的效果。該實驗為桑葉生物堿在改善肝臟疾病方面提供了一些依據(jù)，但于此同時，桑葉生物堿是否直接作用TGF-β1/Smads通路中相關(guān)信號分子，以及本實驗沒有顯著的量效關(guān)系，這是否與靶點或受體飽和有關(guān)，需做進一步研究。此外肝纖維化發(fā)生發(fā)展是多細胞、多因子共同參與的結(jié)果，桑葉生物堿改善肝纖維化的其他途徑也有待進一步探討。