啤酒花浸膏對殼聚糖/聚乙烯雙層膜的性能影響及釋放行為

陳鳳霞，曹 軍，劉玉梅

（新疆大學化學學院，煤炭清潔轉化與化工過程自治區重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830046）

活性包裝是一種創新型包裝，由于其與包裝材料、食品和環境的相互作用，可有效延長食品的貨架壽命，更好地保護口味，在降低防腐劑等食品添加劑用量的同時，又能保持產品的品質，因而備受人們的關注[1]。這種延長保質期的方法是通過在包裝材料的內部或表面添加抗菌劑或抗氧化劑等活性物質，進而通過材料持續擴散釋放到食品表面以抑制微生物生長，減緩微生物生長速度或者減少其成活數量，同時阻隔外部環境對食品的不良作用，從而起到保持產品品質和延長保質期的作用[2]。

添加到包裝材料內的抗菌成分主要為合成抗菌劑（包括無機抗菌劑、有機化學抗菌劑）和天然生物抗菌劑[3]。由于合成抗菌劑的毒性和潛在的致癌作用，在食品包裝中添加天然抗菌劑已成為一種趨勢[4-7]。啤酒花浸膏是啤酒花通過二氧化碳經超臨界萃取得到的天然活性物質，主要包含啤酒花苦味樹脂和精油等化學成分，通常用于啤酒釀造，提供啤酒所需的苦味以及防腐作用[8]。作為食品添加劑和食品包裝材料時同樣具有良好的抗氧化及抑菌效果[9]。

聚乙烯（polyethylene，PE）薄膜由于無毒、無味、無臭、符合食品包裝衛生標準且價格低廉，常用作食品保鮮。作為食品包裝材料，PE具有機械性能良好、低潤濕性和高防潮性等優勢[10]，但是缺乏活性功能。研究者們常直接將精油、迷迭香、兒茶素、沒食子酸等天然活性物質加入PE中制備活性包裝[11-12]。然而活性物質釋放不理想，因為在處理PE時通常處于高溫條件，會導致活性物質的降解。此外，如將活性物質接枝于PE表面，由于它們之間強烈的化學鍵合會導致活性物質難以釋放到食品表面[13]。因此，可將這些化合物依附另一個載體，然后進一步層壓在PE表面上產生雙層膜。殼聚糖是一種從甲殼素中提取的生物高分子材料，以其獨特的高分子結構、生物相容性、生物降解性等內在功能特性引起了科學界和工業界的廣泛關注。殼聚糖及其衍生物常用于食品工業、農業、制藥、醫藥、美容、紡織和造紙工業以及化學等領域[14-16]。在食品包裝方面，因其價格低廉、安全無毒、良好的成模性和較強的抗菌防腐能力，常與各種天然抗氧化劑和抑菌劑結合用于延長食品貨架期[17-19]，但殼聚糖具有較高的水蒸氣透過性，易導致食品失水。因而有學者將殼聚糖與PE膜結合添加活性成分制備雙層膜用于食品的保鮮研究[20]，但對膜的基本理化性能及活性物質的釋放行為研究較少。

本研究將殼聚糖作為載體添加啤酒花浸膏鋪覆于PE表面，目的是開發一種基于啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的活性包裝。并通過研究薄膜的微觀結構、物理特性、抗菌性能以及啤酒花浸膏在抑菌膜中的釋放規律，為食品包裝的開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

大腸桿菌、肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌均保存于新疆維吾爾自治區食品藥品檢驗所。

LB培養基 北京奧博星生物技術有限公司；殼聚糖（脫乙酰度＞90%） 上海藍極科技發展有限公司；超臨界CO2萃取的啤酒花浸膏（α-酸50.82%、β-酸12.87%） 新疆三寶樂農業科技有限公司；PE膜浙江清清美家居用品有限公司；甘油（質量分數≥98%）、乙酸、無水乙醇 天津致遠化學試劑有限公司；其他常用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BS210S型電子天平 德國賽多利斯公司；DF-II集熱式磁力加熱攪拌 金壇市醫療儀器廠；DPH-420型電熱恒培養箱 北京市永光明儀器有限公司；HP-200精密色差儀 東莞市國產精密色差儀廠；UV-5300PC型紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；SU8000場發射掃描電子顯微鏡（scanning electron micrroscope，SEM） 日本Hitachi公司；自制成膜器（17 cm×7.5 cm）。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖/PE雙層抑菌膜的制備

參考前期研究[21]，取2 g殼聚糖溶于90 mL體積分數2%乙酸溶液，70 ℃持續攪拌至完全溶解，冷卻至30 ℃，將1 g甘油溶于5 mL蒸餾水中，緩慢加入殼聚糖溶液，攪拌1 h，再分別加入0、0.1、0.2、0.3 g的啤酒花浸膏（5 mL無水乙醇溶解），使啤酒花浸膏終質量濃度分別為0（對照）、0.1、0.2、0.3 g/100 mL，攪拌1 h，靜置脫氣約12 h，再超聲脫氣2 h，制得的成膜液用延流法鋪于貼有PE膜的自制成膜器中，在37 ℃恒溫培養箱中干燥20 h，制備得到殼聚糖/PE雙層抑菌膜。

1.3.2 膜厚度的測定

每個薄膜隨機選取10 個點用游標卡尺測量，測量精度為±0.001 mm。

1.3.3 色澤、透光率和不透明度的測定

薄膜色澤的測定根據Dou Lixue等[22]的方法，將色差儀用標準的黑白板校準后對每個薄膜樣品至少測定3 次，薄膜的色澤分別用L*值（亮度）、a*值（紅/綠）和b*值（黃/藍）表示。利用紫外-可見分光光度計記錄薄膜200～800 nm波長處在空氣中的透光率。薄膜的不透明度按式（1）計算。

式中：d表示膜的厚度/mm。

1.3.4 水分質量分數和溶解度的測定

將膜裁成1 cm×1 cm的膜片，用分析天平準確稱質量，記為m0/g，放置在表面皿中，在105 ℃烘箱中烘干至恒質量，用分析天平準確稱質量，記為m1/g。將完全烘干后的膜片放入50 mL蒸餾水中，在室溫下浸泡24 h，再放置在烘箱中105 ℃烘干至恒質量，用分析天平準確稱質量，記為m2/g。水分質量分數和溶解度分別按公式（2）、（3）計算。

1.3.5 微觀結構的觀察

利用SEM觀察薄膜的表面微觀結構。在觀察之前，按照儀器說明對樣品進行前處理并粘附于導電膠上噴金處理。

1.3.6 抑菌活性的測定

根據瓊脂擴散實驗法[2]評價雙層抑菌膜的抑菌活性，通過固體培養基上的抑菌區確定薄膜抗微生物的效果。測試菌包括單增生李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎桿菌。取上述5 種菌株加入到無菌的營養瓊脂中，37 ℃下活化24 h，挑取活化后的菌落于質量分數0.85%生理鹽水中，調節濁度至0.50麥氏濁度單位，使菌的濃度為1.5×108CFU/mL。取0.1 mL菌懸液于100 mL LB培養基中混勻，倒入直徑為9 cm無菌培養皿，將膜片裁成直徑為6 mm的圓片，貼附于培養基表面，37 ℃下培養24 h，測量抑菌圈直徑。

1.3.7 膜中啤酒花浸膏的釋放行為測定

依據歐盟委員會指令（EU 10/2011）[23]，定義食品模擬物如下：水，模擬物水性食品；3%（體積分數，下同）乙酸，模擬酸性（pH值＜4.5）食品；10%乙醇，模擬酒精類食品；95%乙醇和異辛烷，模擬高脂肪食品；50%乙醇，模擬高脂肪食品含酒精的產品、牛奶和一些乳制品。本研究中因啤酒花浸膏具有疏水性，既選擇在10%、50%、95%的乙醇模擬體系下進行釋放。

取膜片（3 cm×5 cm）置于100 mL具塞式錐形瓶中，分別加入體積分數為10%、50%、95%的乙醇溶液50 mL，放入恒溫水浴鍋中，以4、25、35 ℃作為遷移溫度，釋放一定時間，取1 mL釋放液按一定比例稀釋，測定其在326 nm波長處的吸光度，根據啤酒花浸膏的標準曲線，計算模擬液中啤酒花浸膏的質量，即為膜片中的釋放量。按公式（4）、（5）分別計算膜片中啤酒花浸膏釋放量及釋放率。

1.4 數據統計分析

所有數據均至少平行測定3 次。使用SPSS 20.0軟件進行數據分析，結果以平均值±標準偏差表示，利用單因素方差分析中的鄧肯氏法進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，采用Origin 8.6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的物理特性

表1 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的物理性能Table 1 Physical properties of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

薄膜的厚度是至關重要的參數，因其會影響食品包裝的其他性能，如水蒸氣和氣體的滲透性、活性化合物的擴散，以及對昆蟲和微生物攻擊的防護。由表1可知，隨著啤酒花浸膏添加量在0～0.2 g/100 mL范圍內的增加，膜的厚度變化不顯著；添加量增至0.3 g/100 mL后，厚度顯著增加，這主要是因為啤酒花浸膏添加量較大導致薄膜表面粗糙程度增加，從而使厚度增加。這與Atef等[24]的結果相似。

啤酒花浸膏的加入改變了殼聚糖/PE膜水親和能力，隨著啤酒花浸膏添加量的增加，溶解度和水分質量分數逐漸降低，與Wang Liyan等[25]將淡竹葉提取物添加到殼聚糖中的結果一致。水親和能力的改變是由于啤酒花浸膏中含有大量的α-酸和β-酸，它們的羥基與殼聚糖的氨基之間存在很強的相互作用，使水分子與殼聚糖鏈上的氨基鏈接受阻。

2.2 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的色澤

薄膜的色澤影響包裝外觀和消費者接受度。如表2所示，與對照組相比，添加啤酒花浸膏顯著降低了膜的L*值，同時顯著提高了a*值和b*值，與殼聚糖中添加蘋果多酚后色澤的變化趨勢[26]相同。然而酒花浸膏添加量從0.1 g/100 mL增加到0.2 g/100 mL時，L*、a*值沒有顯著改變（P＞0.05），但增加到0.3 g/100 mL時兩者均顯著降低。此現象是由于啤酒花浸膏含量較高時在膜液中發生聚集，導致明亮度急劇下降。根據所測的色澤及觀察結果可知，含啤酒花浸膏的膜的色澤比對照膜略深，且色澤略偏黃。

表2 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的色澤Table 2 Color of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

圖1 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的透光率Fig.1 Light transmittance of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

薄膜應用于食品表面時，薄膜的透光性和透明度也是一個非常重要的考察標準。由圖1 可知，在200～800 nm范圍內，隨著啤酒花浸膏添加量的增大，透光率呈下降趨勢。在200～380 nm范圍內添加啤酒花浸膏的膜透光率基本為零，說明該膜相較對照膜更有利于防止紫外線的透過。此外，啤酒花浸膏使殼聚糖/PE膜的不透明度顯著增加（P＜0.05）（表2），說明加入啤酒花浸膏可以改善殼聚糖/PE膜的光阻隔性能，防止食品發生氧化變質。因此，啤酒花浸膏殼聚糖/PE膜更適合用于紫外線敏感的食品包裝。

2.3 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的微觀結構

圖2 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的SEM圖Fig.2 Scanning electron microscopic image of chitosan-coated antibacterial PE bilayer films

利用SEM可觀察到成膜基質微觀結構的相關信息，可有效解釋成膜基質的厚度、力學性能、透氣性等宏觀性能的變化原因。由圖2可知，殼聚糖/PE膜表面可觀察到一些顆粒，這可能是由于成膜液黏度較高造成殼聚糖聚集形成晶粒。但薄膜的表面呈現均勻、光滑、連續的結構，表明殼聚糖具有高度相容性和良好的成膜特性，此結果與de Moraes Crizel等[17]的結果相似。相較于對照膜，添加0.3 g/100 mL啤酒花浸膏的膜出現了相分離情況，使膜表面粗糙且凹凸不平，這種現象可能是由于啤酒花浸膏的結構特性使其不溶于水，在有機溶劑中溶解性更好，從而不能輕易地進入聚合物鏈。因此，可以觀察到因相分離而導致出現了膜表面粗糙、雜亂無章的現象，類似的結果在文獻[27]中也有報道。這也進一步佐證了0.3 g/100 mL啤酒花浸膏的膜厚度相較其他膜偏大。

2.4 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的抑菌活性

表3 含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of chitosan-coated PE bilayer films incorporated with hops extract

通過瓊脂擴散法評價不同添加量啤酒花浸膏抑菌膜對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、肺炎桿菌）和革蘭氏陽性菌（蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌）的抑菌活性。由表3可知，殼聚糖/PE膜對5 株菌均沒有抑菌效果，這與殼聚糖的廣譜抑菌性相反，主要由于增塑劑使殼聚糖分子在膜內的固定化影響了殼聚糖抑菌活性的釋放，導致其抑菌活性下降，此現象與Genskowsky等[28]的結果相似。而添加啤酒花浸膏的膜都顯示出了良好的抑菌活性，并隨著啤酒花浸膏的添加量增加，抑菌圈直徑也逐漸增加。這主要因為啤酒花浸膏中α-酸、β-酸以及啤酒花精油都具有良好的抑菌活性，通過作用于細菌的細胞膜，使細胞膜發生不同程度的皺縮破裂，導致細胞內核酸流出而抑制了細菌生長[29]。此外，啤酒花浸膏對革蘭氏陽性菌敏感程度強于革蘭氏陰性菌，可能是由于其親脂性較強，革蘭氏陰性菌的細胞壁脂多糖會阻止其中的活性成分從細胞質膜滲透[30-31]。

2.5 食品模擬液中酒花浸膏的釋放行為

在目前的研究中，活性包裝膜的釋放取決于不同的因素，如液體向膜基質的遷移、聚合物的溶解度、活性化合物通過膜基質向食品模擬液體的擴散以及由活性化合物與生物基質之間的特定相互作用等不同因素作用[32]。本實驗研究了啤酒花浸膏在3 種不同的食物模擬物（10%、50%、95%乙醇）體系中的釋放規律。圖3顯示了含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層膜在上述3 種食品模擬物中4、25、35 ℃環境下的啤酒花浸膏不同時刻的釋放量。為了更好地解釋不同添加量啤酒花浸膏的釋放行為，繼續研究了特定時間內活性成分（啤酒花浸膏）釋放率的變化，具體結果見圖4。

圖3 殼聚糖/PE雙層抑菌膜中啤酒花浸膏在模擬體系中的釋放量Fig.3 Release amount of hops extract from chitosan-coated PE bilayer films in simulated food systems

由圖3可知，在所有的測試模擬體系中均觀察到相似的釋放曲線，釋放過程都是由快速釋放到緩慢釋放然后進入釋放平衡階段，但是不同食品模擬體系達到最大釋放量和釋放率的時間有所不同。隨著溫度的升高，啤酒花釋放量逐漸增大，且到達平衡所需時間越短。因為隨著溫度的升高，分子擴散加劇，分子間排斥力增大，導致啤酒花浸膏和殼聚糖作用力降低，因此加速了啤酒花浸膏的釋放[33]。隨著模擬液中乙醇體積分數的增加，模擬液中啤酒花浸膏的釋放量增加，由于95%乙醇與啤酒花浸膏具有相似的疏水性，因此它的快速、高釋放水平是可以預期的，這與陳婷等[34]在明膠/殼聚糖膜液中添加啤酒花浸膏的結果相同。

圖4 殼聚糖/PE雙層抑菌膜中啤酒花浸膏在模擬體系中的釋放率Fig.4 Release percentage of hops extract from chitosan-coated antibacterial PE bilayer films in simulated food systems

由圖4可知，隨著啤酒花浸膏添加量的增加，其在模擬體系中的釋放率增加，且釋放平衡所需時間縮短，由于不同添加量啤酒花浸膏在殼聚糖基體中的參與程度不同，導致在聚合物鏈中向模擬物的遷移速率不同，隨著啤酒花浸膏添加量的增加，在成膜液中會發生聚集形成較大的晶體，導致在膜液中分散不均勻，減少了與聚合物分子間的交聯；而添加量較低時分散更加均勻，更容易與殼聚糖發生相互作用[2]。此外，在不同溫度、不同模擬物中啤酒花浸膏的釋放率均小于100%，且0.1、0.2、0.3 g/100 mL啤酒花浸膏添加量薄膜在35 ℃ 95%乙醇體系下的釋放率最大，最大釋放率分別為72.94%、82.60%、94.32%，而在4 ℃ 95%乙醇體系中，該值則依次為65.65%、76.62%、83.71%。結果表明含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜更加適用于高脂類食品的包裝。

3 結 論

本實驗成功制備了一種含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜。啤酒花浸膏的加入使薄膜表面更加粗糙，厚度增加，色澤加深、趨于黃色，同時對紫外-可見光具有優異的屏障活性且綜合各項性能發現，含0.2 g/100 mL啤酒花浸膏的雙層膜性能最佳。在不同時刻、不同溫度下，不同添加量啤酒花浸膏在食品模擬物體系（10%、50%、95%乙醇）中的遷移規律表明，模擬液中乙醇體積分數越高，啤酒花浸膏釋放量越高，且隨著溫度升高，釋放量遞增，釋放平衡時間縮短；在不同添加量下，啤酒花浸膏含量越高，釋放量也越高；因此，含啤酒花浸膏的殼聚糖/PE雙層抑菌膜更適用于高脂體系食品的包裝。與傳統單層包裝膜（塑料包裝、可食性包裝）相比，殼聚糖/PE的雙層包裝既可避免塑料包裝直接接觸食品而可能產生的塑化劑及聚合物單體向食品遷移所引起的潛在風險，又可以彌補殼聚糖阻水能力差的性能，同時啤酒花浸膏高效安全的抑菌活性還使其具備了新的包裝性能。因此，殼聚糖/PE雙層抑菌膜的制備可為其開發提供理論參考。