茶多酚-β-環糊精包合物對羊肚冷藏期間肌原纖維蛋白氧化的影響

冉麗丹，李文慧，趙 超，鐘媛媛，袁湖川，閆青青，朱偉超，董 娟,*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350000）

新疆作為五大牧區之一，擁有傳統的草原牧場和發展草原畜牧業的資源優勢。近年來，人們對肉制品消費量的增加導致畜禽養殖、屠宰、加工業的快速發展，這些過程中會產生大量的副產物，提高其利用率將會減少資源浪費和環境污染[1]。平滑肌是一種存在于動物胃、腸等的肌肉組織，富含膠原蛋白和彈性蛋白，具有其自身特有的質構和風味，而長期以來富含平滑肌的內臟主要被作為副產物處理，未能發揮其食用價值，值得深度開發和加工[2]。新疆養羊業的養殖規模在畜牧業中排行第一，但對羊副產品的開發程度卻還不夠。羊肚補虛、健脾胃，是很有營養價值的高蛋白、低脂肪的平滑肌，其風味獨特、爽滑彈牙，并且富有嚼勁，口感十分適合消費者食用。但由于其水分含量高，容易滋生微生物，不適宜長期貯存，應隨買隨吃。因此，冷藏條件下延長新鮮羊肚的貨架期并研究其肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）的氧化特性對今后新疆羊肉副產品在肉品工業中的綜合利用具有十分重要的作用和指導意義。

近年來，植物多酚因具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抑菌等多種生理功能和廣闊的應用前景成為國內外學者的研究熱點。茶多酚（tea polyphenol，TP）是茶葉中的天然提取物，通過捕獲活性氧和螯合金屬離子，具有強大的抗氧化能力，在食品、醫藥和制藥等領域得到廣泛應用。TP主要由兒茶素類物質（約占60%～80%）組成，與黃酮醇類互相作用使TP比自身任意一種單體的抗氧化活性都高[3-4]。此外，將TP溶液直接噴淋在肉制品表面或用于浸泡肉制品可有效抑制細菌增殖并減緩其氧化過程，從而延長肉制品的貨架期[5]。竇川林[6]、李玲[7]、呂衛金[8]等研究發現，TP對肉制品中蛋白質的氧化可起到一定的抑制作用，不僅能較好地保持肉的品質，還能有效延緩MP的氧化程度。

TP廣泛用于肉制品以減緩加工和貯藏過程中發生的氧化以及產生的不良氣味，然而，其穩定性差、生物利用率低和易分解的特性，使TP在實際應用中存在一定程度的局限性。β-環糊精（β-cyclodextrin，β-CD）外表面親水、中心空腔疏水的截錐體結構[9-10]使其能夠與許多無機、有機分子結合成主客體包合物，從而具有保護、穩定、增溶客體分子和選擇性定向分子的特性[11]。然而，β-CD水溶性較低[12]，使得水溶性好且無毒的2-羥丙基-β-環糊精（2-hydroxypropyl-β-CD，HP-β-CD）被視為最有應用前景的β-CD衍生物。客體分子在形成包合物后，其穩定性、溶解度以及生物利用度提高。Sun Xiuxiu等[13]發現包合可以保護精油的揮發性成分并減弱其特有氣味；Yang Lijuan等[14]發現橙皮素與β-CD及其衍生物HP-β-CD、七烷基-(2,6-二甲基)-β-CD和七烷基(2,3,6-三-O-甲基)-β-CD包合后可以有效提高其穩定性和水溶性；Wei Yongqin等[15]發現根皮素與HP-β-CD形成包合物后顯著提高了其穩定性。然而，有關TP與HP-β-CD的包合物對肉在貯藏過程中MP氧化的影響卻鮮有報道。因此，本實驗以羊肚為研究對象，探討HP-β-CD/TP包合物處理對冷藏期間羊肚MP的影響，以期為TP在食品領域的應用開辟新的途徑，為新疆羊肉副產業的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗所用的新鮮綿羊羊肚由新疆西部牧業股份有限公司提供，購買后隨即放入裝有冰袋的保溫箱中并快速運回實驗室，去除羊肚內的污雜物、表面的油脂和結締組織，清洗干凈后備用。

TP（純度98%，458.372 g/mol，主體成分為兒茶素類） 上海源葉生物科技有限公司；HP-β-CD、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、溴酚藍、無水乙醇、乙酸乙酯、考馬斯亮藍R-250、鹽酸胍、甘氨酸、尿素、溴酚藍、β-巰基乙醇、三氯乙酸 麥克林試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 合肥博美生物科技有限責任公司。

1.2 儀器與設備

Neofuge-15R酶標儀 美國伯爵儀器有限公司；Beta 2-8 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司；Seamus Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜（Fourier infrared spectroscopy，FTIR）儀 賽默飛世爾科技有限公司；熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）儀日本Shimadzu公司；JSM-6490LV掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM） 日本電子公司；DCodeTM System蛋白電泳儀、Mini-protein III凝膠成像儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 HP-β-CD/TP包合物的制備

采用共沉積法[16-17]，以n（HP-β-CD）∶n（TP）為1∶0.5、1∶1和1∶2制備HP-β-CD/TP包合物。先將1.54 g（即0.01 mol）HP-β-CD完全溶于40 mL、體積分數30%乙醇溶液中，再加入不同物質的量比例的TP以達到最終濃度。將溶液置于用錫箔紙包裹的錐形瓶中，然后放在搖床恒溫（40 ℃）振蕩72 h，于4 ℃的冰箱中過夜。經抽濾獲得沉淀物并用30%乙醇溶液洗滌后置于-80 ℃下預冷24 h，冷凍干燥后獲得固體HP-β-CD/TP包合物。物理混合物是將物質的量之比為1∶1的HP-β-CD與TP在研缽中研磨至混合均勻。

1.3.2 HP-β-CD/TP包合物的結構表征及性質

1.3.2.1 FTIR光譜測定

取2 mg HP-β-CD/TP包合物以及物理混合物與溴化鉀按質量比1∶100混合，使用瑪瑙研缽研磨至混合均勻后進行壓片，置于FTIR儀中以2 cm-1的分辨率在4 000～400 cm-1范圍內掃描樣品。

1.3.2.2 熱特性分析

取1 mg HP-β-CD/TP包合物以及物理混合物均勻平鋪在鋁坩堝中，用TGA儀記錄樣品的TGA曲線及微商熱重（derivative thermogravimetry，DTG）曲線，測定條件：氮氣流速為20 mL/min，掃描范圍為40～400 ℃，掃描速率為10 ℃/min。

1.3.2.3 SEM觀察微觀結構

將適量HP-β-CD/TP包合物以及物理混合物固定在樣品臺上，導電膠粘樣后進行噴金處理，置于顯微鏡下觀察其表面形態（加速電壓10 kV）。

1.3.2.4 DPPH自由基清除能力的測定

將HP-β-CD/TP樣品配制成不同質量濃度的水溶液（0～1.0 mg/mL）備用，同時用體積分數95%的乙醇溶液配制成0.02 g/100 mL的DPPH溶液，避光保存。在96 孔板中，取50 μL樣品溶液與375 μL體積分數95%乙醇溶液混合，加入125 μL DPPH溶液混勻，室溫條件下避光處理60 min后，將96 孔板置于酶標儀517 nm波長處掃描，測各個樣品溶液的吸光度（A1）。用去離子水替換樣品溶液作空白對照（A0），通過公式（1）計算DPPH自由基清除率。

1.3.3 HP-β-CD/TP包合物對羊肚MP影響的研究

1.3.3.1 原料處理

將羊肚切分成長7～10 cm左右，隨機分成4 組，每組24 塊（每組設3 個平行）。其中第一組為對照組，即將羊肚置于去離子水中浸泡60 min后取出晾干；而第2～4組則是分別在0.1、0.5 mg/mL和1 mg/mL HP-β-CD/TP包合物（抗氧化最強的比例）溶液中浸泡60 min后取出晾干。裝入無菌自封袋，4 ℃溫度下貯藏7 d，并且每天進行相應指標的測定。

1.3.3.2 MP的提取

MP的提取參照Hashimoto等[18]的方法，并作適當修改。取一定量的羊肚，剪碎后稱取5 g于離心管中，按1∶2（m/V）的比例加入0.03 mol/L的磷酸鹽緩沖液（A液，pH 6.5），勻漿后于4 ℃、5 000 r/min離心15 min，棄去上清液，此操作重復2 次。將所得沉淀按1∶2（m/V）的比例加入0.7 mol/L的磷酸鹽緩沖液（B液，pH 6.5），勻漿后4 ℃、5 000 r/min離心15 min，用脫脂棉過濾后收集上清液，此步驟重復2 次，所得的上清液即為MP溶液，采用Biuret法測定上清液中的MP質量濃度，將其稀釋至MP質量濃度為1 mg/mL后測定相關指標。

1.3.3.3 羰基含量的測定

羰基含量參照李艷青[19]的方法進行測定。取2 mL MP溶液，分別加入2 mL 10 mmol/L DNPH溶液，在室溫下反應1 h（每10 min漩渦振蕩一次），然后加入5 mL質量分數20%三氯乙酸溶液，5 000 r/min離心10 min，棄去清液后，用體積比為1∶1的1 mL無水乙醇和乙酸乙酯混合溶液洗滌沉淀3 次以除去過量的DNPH。最后將沉淀溶于3 mL 6 mol/L的鹽酸胍中，置于37 ℃水浴鍋中30 min使沉淀溶解后，5 000 r/min離心10 min除去不溶物質，取離心后的上清液用酶標儀在370 nm波長處測吸光度，摩爾消光系數取22 000 L/（mol?cm）。

1.3.3.4 總巰基含量測定

總巰基含量參照Jia Dan等[20]的方法進行測定。取1 mL MP溶液于離心管，加入8 mL的Tris-甘氨酸（pH 8.0，每升溶液含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g乙二胺四乙酸、8 mol尿素），5 000 r/min離心20 min后，在上清液中加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑，并于室溫反應0.5 h。最后用酶標儀在412 nm波長處測定吸光度，摩爾消光系數取13 600 L/（mol?cm）。空白組除不加蛋白液外，其他操作均相同。

1.3.3.5 MP游離氨基質量分數的測定

根據B r a n d s 等[21]的方法，采用鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）法測定游離氨基質量分數。準確稱取40 mg的OPA溶解于1 mL無水甲醇中，加入2.5 mL 20 g/100 mL的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、25 mL 0.1 mol/L硼砂和100 μLβ-巰基乙醇后用蒸餾水定容至50 mL，得到OPA溶液。將200 μL MP溶液分別加入到含有4 mL空白液（即OPA溶液中不加OPA）和4 mL OPA溶液的離心管中，混合均勻后在35 ℃水浴鍋中保溫2 min，測其在340 nm波長處的吸光度，二者之差ΔA340nm為游離氨基的凈吸光度。ΔA340nm與空白液組的吸光度（A未氧化）的比值即為游離氨基的相對含量，計算見公式（2）。

1.3.3.6 溶解度的測定

溶解度的測定參考Xiong Youling L.等[22]的方法，并略有改動。先測定稀釋蛋白液的質量濃度，再將稀釋蛋白液5 000 r/min離心20 min，取上清液測定其蛋白質量濃度。蛋白質溶解度按公式（3）計算。

1.3.3.7 表面疏水性的測定

表面疏水性的測定參考李艷青[19]的方法，并略有改動。向1 mL MP溶液中加入200 μL 1 mg/mL的溴酚藍溶液，混勻后于室溫下攪拌10 min后，5 000 r/min離心15 min，取上清液在595 nm波長處測定吸光度（A）。以磷酸鹽緩沖液（0.7 mol/L，pH 6.5）代替MP溶液作為空白組，并按相同方法測定吸光度（A0）。表面疏水性以溴酚藍結合量表征，具體按公式（4）計算。

1.3.3.8 濁度的測定

濁度的測定參考Xiong Youling L.等[22]的方法。取5 mL MP溶液，在30、40、50、60、70 ℃保溫30 min后冰浴冷卻，然后在320 nm波長處測吸光度，以吸光度表征蛋白溶液的濁度。

1.3.3.9 蛋白組分測定

將M P 溶液進行S D S-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），具體參照Laemmli[23]的方法，并略有改動。選用質量分數10%的分離膠和質量分數5%的濃縮膠進行電泳，上樣量15 μL，電泳初始電壓為75 V，當樣品進入分離膠后上調至110 V。

1.4 數據統計與分析

每組實驗重復3 次，用Excel 2016軟件對數據進行統計分析，結果表示為平均值±標準差，采用SPSS 17.0軟件的方差分析（analysis of variance，ANOVA）對數據進行差異顯著性分析（P＜0.05），利用Origin Pro 8.5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 HP-β-CD/TP包合物的結構及表征

2.1.1 FTIR圖分析結果

許多黃酮類化合物的多羥基官能團的O—H鍵通常可以在3 200～3 600 cm-1處出現寬吸收帶[24]。從圖1可知，TP在3 373.78 cm-1處存在O—H鍵的伸縮振動寬峰，在1 205～1 620 cm-1處存在芳香族碳骨架的振動。由于O—H鍵的伸縮振動，HP-β-CD在3 416.08 cm-1處顯示出顯著的吸收帶，2 928.33 cm-1處為C—H的伸縮振動，1 159 cm-1和1 032 cm-1處分別是C—O—C的對稱、不對稱的伸縮振動。HP-β-CD/TP物理混合物的紅外光譜具有加和性，是TP和HP-β-CD譜圖的基本疊加，而包合物的譜圖則呈現出與物理混合物明顯的差異峰。TP的特征峰在包合物的紅外譜圖中減弱或消失，且整個譜圖表現為與HP-β-CD的譜圖相似。與HP-β-CD相比，比例為1∶0.5、1∶1、1∶2的HP-β-CD/TP包合物的C—H不對稱和對稱伸縮振動分別轉移到2 975.65、2 963 cm-1和2 899.48 cm-1處，C—O—C的不對稱彎曲振動分別轉移到1 443、1 412 cm-1和1 388 cm-1處。此外，不同比例包合物在3 409～3 472 cm-1范圍內顯示出羥基顯著的寬吸收帶，且1 320～1 200 cm-1處的C—O伸縮振動被HP-β-CD特征吸收峰掩蓋，這是由于TP進入HP-β-CD的空腔后，其晶體結構進行了重新排列，使其最終構象類似于HP-β-CD，TP的信號消失，表明形成了包合物[25]。FTIR的結果證實了HP-β-CD/TP包合物的形成，還需用其他方法以進一步驗證包合物的形成。

圖1 不同主客體比包合物的FTIR圖Fig.1 FTIR spectra of inclusion complexes with different molar ratios

2.1.2 熱特性分析結果

TGA指溫度在程序控制時，測定物質質量與溫度之間關系的一種熱分析技術，常被用于樣品熱穩定性的評估[26]。不同物質的量之比的HP-β-CD/TP包合物、HP-β-CD/TP物理混合物、HP-β-CD及TP的TGA和DTG曲線如圖2A、B所示。由圖2A可知，HP-β-CD在300 ℃升至350 ℃的過程中質量損失率達到76.40%，在415 ℃時，殘留質量率為26.81%，可能歸因于內部水分蒸發和其自身降解[27]；TP在118～215 ℃之間大量分解，然而HP-β-CD的出現減緩了TP的分解，從而使得包合物的質量損失存在于230～373 ℃之間。在圖2A中，HP-β-CD/TP包合物（a～c）和物理混合物（d）的TGA曲線坡度與水分蒸發和環糊精分解有關，但殘留質量不同。在415 ℃時，與物理混合物（15.76%）相比，1∶0.5、1∶1和1∶2組包合物的殘留質量率分別為17.76%、24.07%和26.59%，這與之前的研究結果[28]一致。此外，DTG光譜中最大質量損失率（曲線最低點）對應的溫度是每個樣品的分解溫度，這與TGA的吸熱現象一致。這些結果表明，與物理混合物相比，主客體相互作用提高了HP-β-CD/TP包合物的熱穩定性。

圖2 不同主客體比包合物的TGA曲線（A）與DTG曲線（B）Fig.2 TGA (A) and derivative thermogravimetry (B) curves of inclusion complexes with different molar ratios

2.1.3 微觀結構分析結果

圖3 不同主客體比包合物的SEM圖Fig.3 SEM images of inclusion complexes with different molar ratios

SEM是介于透射電子顯微鏡和光學顯微鏡之間的一種微觀形貌觀察手段，可直接對HP-β-CD/TP包合物的表面形態進行微觀成像，觀察包合物表面的微觀結構。如圖3所示，TP的表面形態為大小不一的不規則并且帶有棱角的片狀結晶；HP-β-CD相對呈現出球狀形態，并且具有部分不規則的嵌段結構或空腔碎片結構。在HP-β-CD/TP的物理混合物中，兩種形態均能被觀察到，TP分布在HP-β-CD表面及四周，說明主客體分子并沒有發生形態學上的改變，僅僅是兩種物質的物理混合。但包合物的形狀與物理混合物的形狀完全不同，其主要原因是主客體分子的晶格排列在兩者形成的包合物后發生了變化[29]。當TP進入主體分子腔內時與HP-β-CD相互作用，使得客體分子的結晶度降低或消失，因此與物理混合物相比，包合物結構發生了很大變化。HP-β-CD/TP包合物表面顯示出多層均勻的嵌段結構，這是其具有結晶結構的有力證據。這些結果與FTIR和TGA的結果一致。

2.1.4 DPPH自由基清除能力

圖4 不同主客體比包合物的DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging capacity of TP and TP/HP-β-CD inclusion complexes at different molar ratios

DPPH自由基清除能力是評價抗氧化劑抗氧化性的一種廣泛使用的指標。多酚的包封可能會影響其抗氧化活性，酚醛類化合物的抗氧化能力主要取決于羥基的位置和羥基化程度[30]。由圖4可知，隨著樣品質量濃度的增加，各組物質清除DPPH自由基的能力也增加，并且TP經包合后，DPPH自由基清除能力增加，且包合物中TP的比例越高，其DPPH自由基清除能力越高。有研究顯示當抗氧化劑進入環糊精空腔時，酚羥基有可能形成分子內氫鍵，同時增加客體分子的羥基化程度和穩定性，使其更容易與DPPH自由基反應[31]。

2.2 HP-β-CD/TP包合物對羊肚MP氧化的影響

2.2.1 羰基含量

圖5 冷藏期間羊肚MP羰基含量的變化Fig.5 Changes in carbonyl content of MP in ovine tripe during refrigerated storage

許多氨基酸側鏈基團容易被氧化修飾成羰基衍生物，因此，羰基含量通常被用于評估蛋白質氧化修飾的程度[32]。由圖5可知，各組羰基含量隨著貯藏時間的延長均呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。在貯藏第0天，各組之間羰基含量差異不顯著（P＞0.05）。貯藏至第1天，對照組和0.1 mg/mL包合物處理組羰基含量分別增加了42.92%和30.52%（P＜0.05），而0.5、1 mg/mL包合物處理組的羰基含量僅分別增加了24.28%、20.22%（P＞0.05）。在之后的貯藏期內，包合物處理組的羰基值均低于對照組，對照組和0.1、0.5、1 mg/mL包合物處理組在第7天的羰基含量較貯藏初期分別增加了10.26、9.95、9.86 nmol/mg和9.02 nmol/mg。由此可見HP-β-CD/TP包合物的添加有效抑制了氧化誘導導致的MP羰基含量上升，且質量濃度越高，對MP的保護作用越好。這一結果與先前的許多研究一致，即多酚能抑制MP羰基的形成，如在生豬肉餡餅中放入黑加侖提取物[33]、用油菜籽和松樹皮提取物處理熟豬肉餡餅[34]、在豬肝中添加0.1%鼠尾草提取物[35]均能抑制MP的氧化。

2.2.2 總巰基含量

圖6 冷藏期間羊肚MP總巰基含量的變化Fig.6 Changes in total sulfhydryl content of MP in ovine tripe during refrigerated storage

巰基（—SH）對于穩定MP的結構有重要作用，其反應活性很強，易被氧化為二硫鍵（—S—S—），導致蛋白的變性和聚集，因此巰基含量的變化情況可反映蛋白質的變性程度[36]。由圖6可知，各組巰基含量表現為下降趨勢，這與汪金林[37]的研究結果相似。各組初始巰基含量差異不顯著（P＞0.05），與貯藏初始相比，但對照組在第2天顯著下降了28.4%（P＜0.05），包合物處理組均在第4天才下降了30%左右（P＜0.05），這說明HPβ-CD/TP包合物能夠減緩巰基的氧化，而且包合物質量濃度越高，抑制效果越佳。隨后，蛋白質繼續隨著冷藏時間延長逐步氧化降解，對照組和0.1、0.5、1 mg/mL包合物處理組的總巰基含量從初始至貯藏末期分別下降了58.91%、55.57%、50.72%和43.63%，這是由于包埋于蛋白質中的巰基基團不斷暴露并被氧化成二硫鍵[38]，導致MP的空間結構遭到破壞，羊肚品質下降。

2.2.3 游離氨基質量分數

圖7 冷藏期間羊肚MP游離氨基質量分數的變化Fig.7 Changes in free amino content of MP in ovine tripe during refrigerated storage

從圖7可以看出，各組游離氨基質量分數都呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。對照組的游離氨基質量分數在整個貯藏期內下降了27.77%，而0.1、0.5、1 mg/mL包合物處理組分別下降了26.86%、25.65%和23.16%（P＜0.05）。這可能是由于蛋白質側鏈中含有ε-NH2基團的氨基酸參與了羰基的形成，如賴氨酸，在貯藏過程中通過脫氨過程轉化為羰基，后與—NH2共價結合形成席夫堿，進一步降低了游離氨基的質量分數[39]；而HP-β-CD/TP包合物對MP的降解有保護作用，可以有效抑制游離氨基質量分數的降低，其質量濃度也有顯著影響，質量濃度越高，抑制游離氨基酸質量分數降低的效果越明顯。

2.2.4 溶解度

圖8 冷藏期間羊肚MP溶解度的變化Fig.8 Changes in solubility of MP in ovine tripe during refrigerated storage

蛋白質溶解度與其氧化變性程度有關。從圖8可知，貯藏前4 d，MP的溶解度下降速率最快，隨后有所減緩，當到達第7天時，對照組和0.1、0.5、1 mg/mL包合物處理組的溶解度分別降至11.22%、13.34%、18.56%、23.56%（P＜0.05）。總體來看，HP-β-CD/TP包合物的加入對羊肚冷藏過程中MP溶解度的下降具有一定的抑制作用，這種抑制作用與HP-β-CD/TP包合物質量濃度成正比。這可能是因為TP可通過清除氧化自由基來降低蛋白氧化程度，從而阻止了氧化導致的蛋白質分子之間的交聯和聚集，因而改善MP的溶解度，這一結果與蘆丁對豬肉MP的溶解度的影響[40]一致。此外，TP在一定程度上可抑制微生物的增殖，從而能削弱微生物對蛋白的破壞能力，并減緩蛋白質溶解度下降的趨勢[6]。

2.2.5 表面疏水性

圖9 冷藏期間羊肚MP表面疏水性的變化Fig.9 Changes in surface hydrophobicity of MP in ovine tripe during refrigerated storage

表面疏水性反映了蛋白質表面上疏水殘基的分布[41]，通常可用溴酚藍與蛋白的結合量來表示[42]。由圖9可知，隨著貯藏時間的延長，各組MP的表面疏水性均呈現不同程度的增加趨勢，這是因為MP的逐步降解可導致蛋白質部分變性，蛋白結構展開并且分子內部的疏水性氨基酸殘基暴露于親水環境[43]，疏水基團的過多暴露引起蛋白質的交聯，從而導致溶解度的降低和疏水性的增加。此外，包合物處理組表面疏水性相比于對照組明顯較低，且質量濃度越高，β包合物處理組的表面疏水性越低。與第0天相比，貯藏結束時對照組和0.1、0.5、1 mg/mL包合物處理組的表面疏水性分別升高了38.14 μg和37.30、37.77、30.25 μg，這可能是由于TP通過疏水相互作用與MP表面疏水氨基酸的非共價結合形成了新的復合物，掩蔽了疏水基團，不僅直接影響蛋白質分子的構象，還降低了疏水性氨基酸和溴酚藍之間相互結合的可能性，防止部分MP暴露在外界環境中而被氧化[44]。

2.2.6 濁度

圖10 冷藏期間羊肚MP濁度的變化Fig.10 Changes in turbidity of MP in ovine tripe during refrigerated storage

通常蛋白質溶液的濁度是評估蛋白質分子聚集程度的重要指標[45]，它能反映MP在蛋白溶液中的存在狀態。當在濁度變化較大的溫度范圍，MP溶液中顆粒會大量聚集，變性程度也會較嚴重。由圖10可知，MP溶液的濁度隨著貯藏時間的延長和溫度的升高而逐漸增大，并在70 ℃時達到最大值，第7天對照組和0.1、0.5、1 mg/mL包合物處理組在70 ℃下的吸光度分別達到0.508、0.481、0.467和0.461。這是由于MP不斷氧化變性，分子間的疏水性相互作用變大，導致MP溶解度降低，溶液中的懸浮顆粒直徑變大，從而濁度升高。與對照組相比，包合物處理組的濁度相對較低，且包合物質量濃度越高，吸光度相對較小，這是由于HP-β-CD/TP包合物減緩蛋白可溶性聚集物的形成，致使蛋白質濁度相對較低。

2.2.7 蛋白組成分析結果

圖11 冷藏期間羊肚MP的SDS-PAGE分析圖譜Fig.11 SDS-PAGE pattern of MP in ovine tripe during refrigerated storage

蛋白質氧化可誘導結構變化，包括蛋白質之間的交聯以及蛋白質片段的形成，可采用SDS-PAGE來檢測其結構變化[46]。由圖11可知，MP的蛋白條帶較多，含有的蛋白條帶主要有肌動蛋白（43 kDa）和原肌球蛋白（38 kDa），隨著貯藏時間的延長，蛋白條帶均發生了不同程度的降解。對照組貯藏后期的條帶發生了明顯降解，條帶顏色變淺，第7天在靠近肌動蛋白和原肌球蛋白處有新的小分子條帶出現，這說明羊肚在貯藏期間受到其自身蛋白酶和細菌蛋白酶的共同作用分解形成多種片段，致使MP發生變性。0.1 mg/mL包合物處理組的圖譜條帶在貯藏前中期與對照組沒有明顯差異，但從第7天的條帶可以看出，條帶降解的程度比對照組稍弱。而0.5、1 mg/mL包合物處理組在貯藏過程中條帶顏色未出現明顯變淺，這說明HP-β-CD/TP包合物對蛋白質有保護作用，可延緩MP的變性和降解速率，其質量濃度越高，蛋白條帶變化越不明顯。Liu Dasong等[47]對冷藏草魚蛋白質SDS-PAGE圖譜進行分析發現條帶變化不明顯，但這并不說明蛋白質沒有發生氧化分解，可能是由于小分子質量的蛋白質碎片太小而檢測不到。

3 結 論

本研究將TP與HP-β-CD包合制備出不同物質的量之比的包合物，利用FTIR、TGA和SEM表征手段證明了包合物的形成。將抗氧化性最強的HP-β-CD/TP包合物（1∶2）以不同質量濃度（0、0.1、0.5 mg/mL和1 mg/mL）應用于羊肚中，發現其可有效抑制羊肚冷藏過程中MP的氧化并提高其功能特性，具體表現為顯著抑制羊肚中MP羰基含量、表面疏水性、濁度的上升和總巰基含量、游離氨基質量分數、溶解度的下降（P＜0.05），SDS-PAGE結果也表明對照組MP的降解程度更高。由此可見，在一定范圍內，HP-β-CD/TP包合物質量濃度越高，羊肚的品質和鮮度越好，本實驗中1 mg/mL HP-β-CD/TP包合物處理效果最佳。可在今后的研究中進一步探究植物多酚對肉制品蛋白質氧化保護的作用機制以及其對蛋白質的功能特性和結構的影響，為延長肉制品的貨架期提供一定的理論依據。