生物基聚丁內酰胺腸衣膜的性能分析

張添添，陳啟明，趙黎明，姜舒文，陳 濤

（華東理工大學生物工程學院，發酵工業分離提取技術研發中心，生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

香腸是我國肉制品的主要品類之一，占據整體肉制品市場近1/3。2014—2016年我國香腸行業的產量分別約為620、635、618萬 t，市場規模分別約為573.8、608.3、583.6億 元[1]。可見，香腸具有穩定增長的市場需求。

腸衣作為一種重要的肉類包裝，在國內外都具有非常強的消費剛性。其基本功能是保證香腸在一定條件及時間內不變質，以滿足貯存及流通的需要。腸衣主要有天然腸衣和人造腸衣，天然腸衣是采用健康牲畜腸道制備灌制香腸的衣膜[2]，可食用、口感好。但動物腸道的個體差異導致天然腸衣殘次品率高，不利于機械化生產且資源有限[3-4]。人造腸衣主要包括膠原蛋白腸衣和塑料腸衣。膠原蛋白腸衣是以豬、牛皮真皮層的膠原蛋白纖維為原料，加入輔料后經化學和機械處理制成[5]，厚度均勻、氨基酸含量豐富、具有可食性，適用于機器灌腸生產。但膠原蛋白腸衣的蛋白質分子質量分布較窄且分子質量低，導致其機械性能不好，在嚴苛的加工條件下可能會發生崩解，應用范圍有限[6-8]。大部分人造腸衣屬于塑料腸衣，多為復合膜或共混擠出膜，由于加入了很多低熔點的烯烴類材料和助劑，其機械強度高，利于生產和加工，但是塑料腸衣不可降解，能夠給環境造成負擔。因此，研究一種具備優良力學性能和阻隔性能且可降解的腸衣，對于香腸產業未來的發展有重要的意義。

聚丁內酰胺（polybutyrolactam，PA4）又稱聚酰胺4，分子式為[NH(CH2)3CO]n。PA4是一種生物基材料，可通過生物發酵的γ-氨基丁酸經高壓聚合得到[9-11]。PA4已被證明可被海水和土壤中的微生物降解，具有優異的生物降解性[12-16]，是目前發現的唯一可生物降解的聚酰胺。此外，PA4具有高強度、耐磨性和生物相容性等特點，在食品包裝方面具有極大的應用潛力。然而，PA4的分子鏈間氫鍵密度大，極易結晶，導致其韌性較差，因此需要通過與其他材料共混以改善其力學性能。殼聚糖（chitosan，CS）由甲殼素經脫乙酰得到，是迄今發現的唯一天然堿性多糖，具有抗菌、抗氧化、生物相容性、生物可降解等性質[17-19]，可作為抗菌劑、保鮮劑、澄清劑等應用于食品和保健品[20]。CS可與聚酰胺類聚合物共同混合形成一定的相互作用，從而改善聚酰胺的力學性能[21-27]。因此，本實驗室前期采用流延法以可降解生物基PA4為主體，與CS共混制備出一種可降解型生物基PA4腸衣膜，但是目前PA4腸衣膜在腸衣包裝中的基本性能尚不明確。

本實驗以PA4腸衣膜為對象，比較其與市售尼龍復合腸衣和市售膠原蛋白腸衣在力學性能、阻隔性能、熱收縮率、耐撕裂性能、總遷移量、抗菌性能及對豬肉香腸的保鮮性等方面的差異，探究了PA4腸衣膜在腸衣包裝應用上的價值，評價了PA4腸衣膜的優劣勢，為其在肉類包裝領域中的應用提供參考，并拓展環保腸衣材料的開發。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

大腸桿菌CICC23657為實驗室分離菌株；PA4腸衣膜由實驗室自制。

體積分數95%乙醇（分析純） 上海泰坦科技股份有限公司；高嶺土（分析純）、無水乙醇（分析純）阿拉丁試劑（上海）有限公司；胰蛋白大豆肉湯液體培養基、卵磷脂吐溫大豆酪蛋白（soya casein digest lecithin Tween polysorbate，SCDLP）培養液、平板計數瓊脂培養基 杭州百思生物科技有限公司；尼龍復合腸衣（以PA6和聚烯烴為主體，多層復合結構膜） 天津市潤澤塑料包裝制品有限公司；膠原蛋白腸衣（以牛皮二層蛋白為主體） 廣西神冠控股（集團）有限公司；豬肉香腸原料為市售。

1.2 儀器與設備

HSX-150恒溫恒濕箱 上海海向儀器設備廠；TM210萬能試驗機 廣東東莞歐美奧蘭檢測設備有限公司；W3/031水蒸氣透過率測試儀、VAC-V2壓差法氣體滲透儀 濟南蘭光機電技術有限公司；Nicolet 5700型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 PA4腸衣膜的制備

PA4腸衣膜采用流延法制備，將PA4和CS按照一定比例溶解后進行共混，置于恒溫恒速磁力攪拌器中均勻分散12 h，靜置1 h脫泡，得到PA4腸衣膜液后，流延澆注在玻璃模具上，于30 ℃、相對濕度55%的恒溫恒濕箱中烘干后，揭膜，得到PA4腸衣膜。其中，CS所占的質量比例不超過50%。同時，將PA4溶解后，采用流延法制備純PA4膜，留作備用。

1.3.2 力學性能測定

PA 4 腸衣膜與市售腸衣拉伸強度和斷裂伸長率的測定參照GB/T 1040.1—2018《塑料 拉伸性能的測定 第1部分：總則》[28]。將PA4腸衣膜和市售腸衣裁成150 mm×14 mm的條狀，樣品兩端固定于十字夾具，設定標線距離為100 mm，拉伸速率50 mm/min。同時以PA4膜為對照，測定其力學性能。每種樣品設置5 個平行，取平均值。按照式（1）和式（2）分別計算拉伸強度和斷裂伸長率。

式中：σ為拉伸強度/MPa；F為最大負荷/N；b為樣品寬度/mm；d為樣品厚度/mm。

式中：ε為斷裂伸長率/%；L為樣品斷裂時標線的距離/mm；L0為原始標線距離/mm。

1.3.3 阻氧性能測定

PA4腸衣膜與市售腸衣的氧氣透過系數測定參照GB/T 1038—2000《塑料薄膜和薄片氣體透過性試驗方法壓差法》[29]。將PA4腸衣膜和市售腸衣裁成直徑為9 cm的圓片，置于實驗臺中間，用真空脂密封邊緣，蓋上測試腔。輸入樣品的厚度，溫度23 ℃，抽真空6 h，進行氧氣透過性能測試。按照式（3）計算氧氣透過系數。

式中：pg為氧氣透過系數/（cm3·cm/（cm2·s·Pa））；Δp/Δt表示在氧氣穩定透過時，單位時間內低壓室氣體壓力變化的算術平均值/（Pa/s）；V為低壓室體積/cm3；S為樣品的面積/cm2；p1-p2為樣品兩側的壓力差/Pa；T0、p0分別表示標準狀態下的溫度（273.15 K）和壓力（1.013 3×105Pa）；D為樣品的厚度/cm；T為實驗溫度（296.15 K）。

1.3.4 阻水性能測定

PA4腸衣膜與市售腸衣的水蒸氣透過系數測定參照GB/T 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸氣性試驗方法 杯式法》[30]。將PA4腸衣膜和市售腸衣裁成直徑7.3 cm的圓片，貼在加入10 mL去離子水的透濕杯上，置于測試倉內密封。輸入樣品的厚度，相對濕度為90%，溫度38 ℃，循環稱質量6 次，每次間隔5 min，進行水蒸氣透過性能測試。按照式（4）計算水蒸氣透過系數。

式中：pv為水蒸氣透過系數/（g·cm/（cm2·s·Pa））；t為質量增量穩定后的前后間隔時間/h；Δm為t時間內的質量增量/g；S為樣品的透水蒸氣有效面積/cm2；D為樣品的厚度/cm；Δp為樣品兩側的水蒸氣壓差/Pa。

1.3.5 熱收縮率測定

PA 4 腸衣膜與市售腸衣的熱收縮率測定參照GB/T 12027—2004《塑料 薄膜和薄片加熱尺寸變化率試驗方法》[31]在160 ℃下進行，按照張啟綱等[32]的方法計算橫向熱收縮率和縱向熱收縮率。

1.3.6 總遷移量測定

總遷移量是食品接觸材料的安全質量指標之一，不同腸衣材料向香腸中遷移的非揮發性物質總量即為總遷移量。參照GB/T 31604.8—2016《食品安全國家標準 食品接觸材料及制品 總遷移量的測定》[33]和GB/T 4806.1—2016《食品安全國家標準 食品接觸材料及制品 通用安全要求》[34]進行測定。以體積分數10%乙醇和95%乙醇作為食品模擬物浸泡液，40 ℃全浸沒10 d。將只加入浸泡液設置為空白對照。同時測定純PA4膜在10%乙醇浸泡液的總遷移量。按照式（5）計算總遷移量（overall migration limit，OML）。樣品和空白對照組都設置3 個平行，取平均值。

式中：OML為總遷移量/（mg/dm2）；m1為樣品測定消耗的浸泡液殘渣質量/mg；m2為空白浸泡液殘渣質量/mg；V為樣品浸泡液總體積/mL；V1為測定消耗的浸泡液體積/mL；S為樣品與浸泡液接觸面積/dm2。

對PA4腸衣膜在體積分數10%乙醇中進行遷移實驗后的總遷移物（記作PA4C-OML）進行紅外光譜表征，并與PA4腸衣膜（記作PA4C）和CS膜的紅外譜圖進行比對。

1.3.7 耐撕裂性能測定

PA4腸衣膜與市售尼龍復合腸衣的耐撕裂力和撕裂強度參照GB/T 16578.1—2008《塑料薄膜和薄片 耐撕裂性能的測定 褲形撕裂法》[35]進行測定。

1.3.8 抗菌性能評價

PA 4 腸衣膜與市售腸衣的抗菌性能測定參照GB/T 31402—2015《塑料 塑料表面抗菌性能試驗方法》[36]。將腸衣膜和市售腸衣裁成2.5 cm×2.5 cm的正方形，把無抗菌性能的聚乙烯（polyethylene，PE）膜裁成2.0 cm×2.0 cm的正方形作為覆蓋膜，紫外照射殺菌12 h。取10 μL大腸桿菌菌液到胰蛋白大豆肉湯液體培養基，37 ℃、150 r/min，培養至OD值達到0.6左右。將樣品膜放入無菌的培養皿中，測試面朝上，吸取100 μL接種液，滴加到膜表面，用PE膜蓋于接種菌液上。同時接種到PE膜表面，作為空白組。接種后37 ℃培養24 h，將膜轉移至SCDLP培養液中，充分沖洗和振蕩，回收菌液。對回收的菌液進行10 倍梯度稀釋，各取稀釋液100 μL接種到平板計數瓊脂培養基上進行涂布。37 ℃培養48 h后計數。根據式（6）計算活菌數，根據式（7）計算抗菌性能（R值表示抗菌性能，R＞1表示具有一定的抗菌性，且R越大，抗菌性越好；R＜1表示無抗菌性）。

式中：N為活菌數/（CFU/cm2）；C為兩個培養皿的平均菌落數/（CFU/mL）；D為稀釋倍數；V為用于洗脫的SCDLP培養液體積/mL；S為覆蓋膜的表面積/cm2。

式中：R為抗菌性能（l g（C F U/c m2））；Ut為未經抗菌處理樣品接種后24 h菌落數的對數平均值（lg（CFU/cm2））；At為經抗菌處理樣品接種后24 h菌落數的對數平均值（lg（CFU/cm2））。

1.3.9 對豬肉香腸保鮮性的影響

豬肉香腸的制備方法：稱取500 g豬肉（53%（以原料總質量計，下同））、谷氨酰胺轉氨酶（0.65%）、鹽（2%）、糖（2%）、大豆蛋白（3%）、玉米淀粉（10%）、紅曲紅（0.05%）、復合磷酸鹽（0.7%）、冰水（2 7.5%）、酪蛋白鈉（1%）、亞硝酸鈉（0.1%），用攪拌機進行混合，將混合均勻的豬肉香腸原料填充到PA4腸衣膜和市售腸衣中，90 ℃水浴加熱30 min殺菌，然后迅速冷卻，4 ℃下貯存。

菌落總數測定：在貯存0、7、14、21、28 d時，參照GB/T 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[37]對不同腸衣材料制備的香腸分別測定菌落總數。

1.4 數據處理與分析

采用Origin 8.0軟件和GraphPad Prism 8.0軟件進行數據處理與分析，采用t檢驗進行顯著性差異分析，顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 力學性能測定結果

圖1 不同腸衣材料的拉伸強度（A）和斷裂伸長率（B）Fig.1 Tensile strength (A) and elongation at break (B) of different casing materials

腸衣的力學性能是香腸加工、運輸和貯存的重要保障，是防止過度內部-外部相互作用的有效屏障，能夠影響包裝的耐久性[38]。圖1為不同腸衣材料的拉伸強度（圖1A）和斷裂伸長率（圖1B）。PA4腸衣膜的拉伸強度為84.42 MPa，斷裂伸長率為73.34%，已達到GB/T 17030—2008要求（拉伸強度≥60 MPa，斷裂伸長率≥50%）[39]，相比于純PA4膜力學性能明顯提高。原因是PA4腸衣膜中添加了CS，CS的氨基與PA4的酰胺鍵之間能產生一定的氫鍵相互作用，從而增強PA4的拉伸強度和斷裂伸長率。此外，與市售腸衣相比，PA4腸衣膜的力學性能優于市售膠原蛋白腸衣，略低于市售尼龍復合腸衣。市售膠原蛋白腸衣中的蛋白質分子質量一般不高，因此其延展性差，所以斷裂伸長率較低。市售尼龍復合腸衣是由PA6和聚烯烴類以及多種塑料助劑形成的多層復合結構，具有較好的力學性能。

2.2 阻氧性能測定結果

腸衣作為肉類包裝材料，高阻氧性可避免肉類受到微生物污染、脂質氧化、腐敗變質等食品安全問題[40]。圖2是不同腸衣材料的氧氣透過系數。PA4腸衣膜、市售尼龍復合腸衣、市售膠原蛋白腸衣的氧氣透過系數分別為2.448×10-16、1.283×10-15、2.385×10-15cm3·cm/（cm2·s·Pa）。PA4腸衣膜的阻氧性最優。市售尼龍復合腸衣主體成分為PA6，相比于PA4，其含有的連接強極性基團的酰胺鍵密度較低，因此阻隔氧氣等非極性氣體的能力更低。晶體是影響阻隔作用的重要因素，結晶度高、晶體含量高、阻氧性強，雖然市售膠原蛋白腸衣的酰胺鍵含量高于市售尼龍復合腸衣，但是市售膠原蛋白腸衣的原料來源于牛皮提取的膠原蛋白，含有的氨基酸種類多，分子鏈短、規整性差、結晶度低，所以阻氧性低于含有長鏈高分子的市售尼龍復合腸衣。

圖2 不同腸衣材料的氧氣透過系數Fig.2 Oxygen permeability coefficients of different casing materials

2.3 阻水性能測定結果

圖3 不同腸衣材料的水蒸氣透過系數Fig.3 Water vapor transmission coefficients of different casing materials

肉類包裝環境中的水分含量高，會促進微生物生長，微生物滋生易造成食品腐敗，從而影響產品的品質和貨架期。圖3為不同腸衣材料的水蒸氣透過系數。PA4腸衣膜、市售尼龍復合腸衣、市售膠原蛋白腸衣的水蒸氣透過系數分別為2.046×10-13、2.042×10-14、1.082×10-12g·cm/（cm2·s·Pa）。PA4腸衣膜阻水性優于膠原蛋白腸衣，次于市售尼龍復合腸衣。這是由于膠原蛋白腸衣中的蛋白質分子質量低，分子鏈間纏結作用差，水分子易透過，同時酰胺鍵密度大，造成其吸水性強；市售尼龍復合腸衣中PA6酰胺鍵密度最低并含有非極性的聚烯烴成分，且為多層復合膜結構，因此具有較好的阻水性能。

2.4 熱收縮率測定結果

腸衣的熱收縮率過大會造成腸體包裹不緊實，浪費包裝；熱收縮率過小，易導致腸體變形或撐破腸衣。因此，適宜的熱收縮率能夠提高商品的外觀性，降低包裝成本。表1為不同腸衣材料的熱收縮率。PA4腸衣膜、市售尼龍復合腸衣、市售膠原蛋白腸衣的橫向熱收縮率分別為-2.5%、-13%、-0.5%，縱向熱收縮率分別為-2.5%、-18%、-1%。玻璃化轉變溫度是高分子聚合物從玻璃態轉變為高彈態所對應的溫度，即聚合物分子鏈段可以運動的最低溫度。高分子聚合物的玻璃化轉變溫度越低，分子鏈運動的阻力越小，受熱后越易發生變形，因此，在同一受熱條件下，玻璃化轉變溫度低的材料更易于分子鏈熱運動，發生鏈的蜷縮，從而產生熱收縮。市售尼龍復合腸衣中PA6和聚烯烴的玻璃化轉變溫度低于PA4[41-42]，因此市售尼龍復合腸衣具備更高的熱收縮率。

表1 不同腸衣材料的熱收縮率Table 1 Heat shrinkage rates of different casing materials

2.5 耐撕裂性能測定結果

圖4 不同腸衣材料的耐撕裂力（A）和耐撕裂強度（B）Fig.4 Tear force (A) and tear resistance (B) of different casing materials

耐撕裂性能是影響腸衣使用方便性的重要因素，耐撕裂力過小，不利于香腸包裝或貯存；耐撕裂力過大，在香腸食用時不方便。實驗過程中，市售膠原蛋白腸衣在撕裂時不能沿著樣品的中心線撕裂到底端，根據GB/T 16578.1—2008要求[35]，耐撕裂性能較差，無法計算。圖4為不同腸衣材料的耐撕裂力和耐撕裂強度。PA4腸衣膜、市售尼龍復合腸衣的耐撕裂強度分別為33.47、40.85 MPa，耐撕裂力分別為1.98、2.25 N。PA4腸衣膜和市售尼龍復合腸衣的耐撕裂性能相仿，且達到GB/T 17030—2008中所規定耐撕裂力≥0.20 N的要求[39]，且PA4腸衣膜的耐撕裂性能小于市售尼龍復合腸衣，更方便香腸食用。

2.6 抗菌性能測定結果

表2為不同腸衣材料的抗菌性能。PE膜、PA4腸衣膜、市售尼龍復合腸衣、市售膠原蛋白腸衣的活菌數分別為1.35×104、10、1.00×104、1.85×104CFU/cm2，PA4腸衣膜、市售尼龍復合腸衣、市售膠原蛋白腸衣的抗菌性能分別為3.13、0.13、-0.13（lg（CFU/cm2））。表明市售尼龍復合腸衣和市售膠原蛋白腸衣抗菌性能均較差，PA4腸衣膜具有良好的抗菌性能。PA4腸衣膜含有的CS是一種天然堿性多糖，其結構內含有的游離氨基能夠被質子化，與細菌細胞膜的負電離子相結合，從而破壞細菌的細胞壁，起到抑制微生物生長的作用[43]。

表2 不同腸衣材料的抗菌性能Table 2 Antibacterial activity of different casing materials

2.7 總遷移量的測定結果

GB/T 4806.7—2016《食品安全國家標準 食品接觸用塑料材料及制品》規定[44]，食品接觸用塑料材料及制品的總遷移量限量為10 mg/dm2。表3是兩種不同條件下不同材料的總遷移量。在體積分數95%乙醇模擬液中，市售尼龍復合腸衣和PA4腸衣膜中的總遷移量均在限量以下，而市售膠原蛋白腸衣的總遷移量超過限量；在體積分數10%乙醇模擬液中，市售尼龍復合腸衣和純PA4膜中的總遷移量在限量以下，市售膠原蛋白腸衣和PA4腸衣膜的總遷移量超過限量。

對PA4腸衣膜的總遷移物進行紅外光譜分析鑒定。圖5是PA4C、CS膜和PA4C-OML的紅外光譜圖。PA4中因含有—CO—NH，酰胺I帶位于1 630 cm-1處，酰胺II帶位于1 540 cm-1處。O—H和N—H的伸縮振動重疊形成多重吸收峰，CS在3 440 cm-1處產生寬譜帶，另外，CS由于C3—OH的C—O伸縮振動在1 120 cm-1和1 025 cm-1處出現特征峰。PA4C-OML在3 440 cm-1附近均有寬的特征峰，在1 120 cm-1和1 025 cm-1處也出現特征峰，在1 630 cm-1和1 540 cm-1處出現微弱的特征峰，且純PA4膜在體積分數10%乙醇中的總遷移量僅有2.39 mg/dm2，證明PA4腸衣膜在體積分數10%乙醇中總遷移物超量的主體是CS。CS是食品原料，無毒性，可食用，不會造成食品安全問題[45]。

表3 兩種不同條件下不同材料的總遷移量Table 3 Overall migration limits of different casing materials when contacting with food simulants

圖5 PA4C、CS膜和PA4C-OML的紅外光譜Fig.5 Fourier transform infrared spectra of PA4C, CS film and PA4C-OML

2.8 豬肉香腸不同貯存期的菌落總數測定結果

香腸變質主要是由微生物生長繁殖引起的，香腸中菌落總數低于5（lg（CFU/g））時才可以安全食用[46]。圖6是不同腸衣材料制備的豬肉香腸菌落總數變化。香腸在0～28 d貯存過程中，市售尼龍復合腸衣和PA4腸衣膜包裝的豬肉香腸菌落總數均低于限量，并且腸衣表面無變黏和發霉現象，滿足食品安全要求。由市售膠原蛋白腸衣包裝的豬肉香腸在第21天時菌落總數為5.28（lg（CFU/g）），且腸衣材料表面變黏，第28天時菌落總數為6.09（lg（CFU/g）），腸衣材料表面發霉。PA4腸衣膜保鮮性能明顯優于膠原蛋白腸衣，但稍差于市售尼龍復合腸衣，可能的原因是市售尼龍復合腸衣阻水性優于PA4腸衣膜。

3 結 論

本實驗探究了實驗室自制的以可降解生物基PA4和CS為原料制備的生物基PA4腸衣膜性能。PA4腸衣膜具有良好的力學性能、熱收縮率和耐撕裂性能，滿足塑料腸衣的標準要求，阻氧性能、抗菌性能優于市售尼龍復合腸衣和市售膠原蛋白腸衣，阻水性能優于市售膠原蛋白腸衣。PA4腸衣膜在體積分數95%乙醇模擬液中，總遷移量符合限量要求，且低于市售尼龍復合腸衣和市售膠原蛋白腸衣，更加安全可靠；在體積分數10%乙醇模擬液中，遷移物的主體為CS，無安全問題。此外，PA4腸衣膜具有良好的抗菌活性，可更好地應用于食品保鮮，從而減少包裝和肉類產品中防腐劑的使用，綠色安全，在4 ℃可貯存豬肉香腸28 d，保鮮性優于市售膠原蛋白腸衣，在低溫肉制品中具有很好的應用潛力。

后期可通過制備多層復合膜，進一步改善PA4腸衣膜的力學性能和阻水性能，從而進一步延長食品貨架期，擴大其在肉類食品包裝方面的應用范圍。