高濕貯藏對青椒果實冷害和抗氧化活性的影響

張 萌，曹婷婷，程紫薇，金文淵，金 鵬，鄭永華,*

（1.南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095；2.蘇州大福外貿食品有限公司，江蘇 蘇州 215000）

青椒（Capsicum annuumL.）又稱甜椒、菜椒，為茄科辣椒屬草本植物，其營養物質十分豐富，具有開胃消食、降壓減脂和抗氧化等功效[1-2]。由于青椒的含水量高，采后在常溫下生理代謝旺盛，具較高的呼吸強度和蒸騰速率，極易失水萎蔫，導致其商品性大大降低。低溫貯藏可降低青椒果實的采后生理代謝，有效延長貯藏期，但青椒是一種冷敏性蔬菜，當貯藏溫度低于7～9 ℃時即發生冷害，出現果面點蝕凹陷、花萼褐變、果實發軟等冷害癥狀[3-5]，嚴重影響其外觀和食用品質。目前已有間歇升溫[3]、熱水處理[5]、甘氨酸甜菜堿處理[6]等物理和化學方法來減輕青椒果實冷害的研究，顯示研發安全和高效的采后處理方法對減輕青椒果實冷害及其冷鏈貯運具有重要的實踐意義。

貯藏環境的相對濕度（relative humidity，RH）是影響新鮮果蔬蒸騰作用的主要因素，與果蔬貯藏期長短密切相關。低RH條件下貯藏的果蔬極易發生失水萎蔫，從而造成品質劣變，縮短貯藏期。而高濕的貯藏環境可顯著抑制蒸騰失水造成的產品失鮮，如王劍功等[7]發現90%～96% RH貯藏條件能顯著延緩菠菜和韭菜的蒸騰失水和萎蔫，保持其新鮮度。Ktenioudaki等[8]研究發現，高濕貯藏可降低草莓果實的質量損失率，維持較高的VC和花青素等營養物質含量，因而具有良好的保鮮效果。但有關RH條件對果蔬冷害影響的研究較少。前人研究表明采用塑料薄膜包裝等保濕的高濕貯藏方式可顯著降低番茄[9]和臍橙[10]的冷害發生率，延長貯藏期。因此新鮮果蔬貯藏要求較高的環境濕度，一般RH要控制在85%～95%[11]。但目前普通冷庫的RH僅為70%～75%，不能滿足果蔬貯藏的需求。采用塑料薄膜包裝保濕因簡單易行而得到普遍應用，但不符合綠色環保的發展理念；采用超聲波和高壓噴霧技術對庫體加濕因水霧顆粒較大，低溫下易發生結露現象，導致病原菌的滋生和果蔬腐爛率的升高[12-13]。而干霧濕度控制系統產生的水霧顆粒直徑僅為2～10 μm，能均勻地擴散到空氣中，可提供90%～99%精確均勻的高RH而不會在果蔬表面結露。采用該加濕技術的高濕冷庫貯藏可顯著抑制奶白菜、番石榴、青花菜等果蔬的失水和品質劣變，并可有效減輕黃瓜果實的冷害癥狀，延長貯藏期[14-16]，顯示干霧控濕高濕貯藏方式在果蔬冷鏈貯運保鮮中有良好的發展前景。但有關干霧控濕高濕貯藏對青椒等其他冷敏性果蔬冷害的影響鮮見報道。本實驗研究了干霧控濕高濕冷庫和普通低濕冷庫貯藏對典型冷敏性蔬菜青椒冷害、品質以及活性氧代謝的影響，以期從果實抗氧化系統角度探究高濕貯藏減輕青椒果實冷害的作用和機理，為高濕貯藏應用于青椒的冷鏈貯運提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為‘圓椒875’，購于蘇州市吳中區金庭鎮東河農貿市場。選擇大小適中、果面光滑、無機械傷和病蟲害的青椒備用。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鉬酸銨、草酸、水楊酸、愈創木酚、鹽酸羥胺、四氯化鈦、α-萘胺、碳酸鈣粉 上海麥恪林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2）、乙酸鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮（crosslinking polyvinylpyrrolidone，PVPP）、曲拉通（Triton X-100） 北京索萊寶科技有限公司；抗壞血酸、甲硫氨酸（methionine，Met）、氮藍四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）、核黃素、聚乙二醇6000（PEG） 上海瑞永生物科技有限公司；偏磷酸、硫酸亞鐵（FeSO4） 上海源葉生物科技有限公司；丙酮、濃氨水、乙醇、乙酸、過氧化氫、對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司；硫酸、鹽酸 南京化學試劑股份有限公司；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

濕度控制系統 以色列Hygrotech公司；RS-YS-W-A型GSP無線溫濕度測點、RSWS-ETH-6型以太網溫濕度記錄儀 山東仁科測控技術有限公司；UV-1200型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；GL-20G-H冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；DDS-11A電導率儀 上海第二分析儀器廠；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋上海森信實驗儀器有限公司；FA1104電子天平 上海精密科學儀器有限公司；TA-XT2i質構儀 英國Stable Micro Systems公司；PAL-1QL-861型振蕩儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將青椒果實隨機分為兩組，放入鋪有泡沫網墊的塑料周轉筐（810 mm×570 mm×500 mm）中，每組18 筐，每筐20 個果實，將其放入4 ℃的干霧控濕高濕冷庫（R H 9 6%～9 9%）和普通低濕冷庫（RH 70%～75%）。每3 d從兩個冷庫中隨機取出青椒各60 個，用于冷害指數、相對電導率和硬度的測定，同時取果實可食部位樣品于液氮中速凍后在-80 ℃下貯藏用于其他指標的測定。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 冷害指數和相對電導率的測定

冷害指數的測定參照侯建設等[17]的方法，按照冷害斑面積的大小將青椒果實的冷害程度分為4 級：0級，無冷害癥狀；1級，輕微冷害，冷害斑面積不超過果面積的10%；2級，中度冷害，冷害斑面積占果面積的10%～40%；3級，嚴重冷害，冷害斑面積超過果面積40%。冷害指數按照公式（1）計算。

式中：i為冷害級別；ni為發生i級冷害的果實個數；N為果實總數。

相對電導率的測定參照姚文思等[18]的方法，并略作修改。用直徑為1 cm的打孔器從青椒果實的中間部位取下5 個小圓片，將其置于20 mL的蒸餾水中，充分振蕩后立即測量浸出液的電導率（κ0/（S/cm）），然后在室溫下靜置30 min，再次測量其電導率（κ1/（S/cm）），最后將浸出液煮沸20 min并充分冷卻，測量其電導率（κ2/（S/c m））。相對電導率按照公式（2）計算。

1.3.2.2 質量損失率和果實硬度的測定

質量損失率采用稱質量法進行測定。稱貯藏前青椒的質量為（m1/g），貯藏固定時間后將青椒從冷庫中取出立即放到電子天平上稱質量（m2/g），防止空氣中的水蒸氣凝結而影響青椒質量。質量損失率按照公式（3）計算。

果實硬度采用質構儀進行測定，選用直徑為2 mm的P/5型不銹鋼探頭，起始力為0.4 N，穿刺距離為3 mm，測定速率為1.0 mm/s，單位為N。

1.3.2.3 葉綠素、抗壞血酸、總酚和總黃酮含量的測定

葉綠素含量的測定參照Xing Yage等[19]的方法，并略作修改。取1 g青椒樣品，加入6～7 mL 80%（體積分數，下同）預冷丙酮、少量石英砂和碳酸鈣粉充分研磨，12 000 r/min離心20 min，將上清液轉入10 mL容量瓶后繼續加入2～3 mL 80%預冷丙酮進行二次提取，重復上述步驟，定容。分別測定上清液在646 nm和663 nm波長處的吸光度。

抗壞血酸含量采用鉬藍比色法進行測定。

總酚和總黃酮含量的測定參照Wang Li等[20]的方法。

以上指標結果均以干質量計，單位為mg/g。

1.3.2.4 抗氧化酶活力的測定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的測定參照Xing Yage等[19]的方法。取1 g青椒樣品，用5 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.8）進行充分研磨，12 000 r/min離心20 min后得到粗酶液。反應體系包括2.6 mL反應液（含0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液1.7 mL、13 mmol/L Met 0.3 mL、750 μmol/L NBT 0.3 mL、100 μmol/L EDTA-Na20.3 mL）、0.1 mL粗酶液和0.3 mL 20 μmol/L核黃素溶液。以每分鐘反應體系在560 nm波長處對NBT光化還原的抑制為50%時所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

過氧化氫酶（catalase，CAT）活力的測定參照Cakmak等[21]的方法。取1 g青椒樣品，用5 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）進行充分研磨，12 000 r/min離心20 min后得到粗酶液。反應體系包括3.5 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液、0.2 mL 0.75% H2O2和0.3 mL粗酶液。以每分鐘反應體系在240 nm波長處吸光度減少0.01為一個酶活力單位（U）。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照Kochba等[22]的方法，并略作修改。取1 g青椒樣品，用5 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5，含1 mmol/L PEG、4 g/100 mL PVPP和1% Triton X-100）進行充分研磨，12 000 r/min離心20 min后得到粗酶液。反應體系包括3.0 mL 25 mmol/L愈創木酚、0.15 mL粗酶液和0.2 mL 0.5 mol/L H2O2。以每分鐘反應體系在470 nm波長處吸光度增加1為一個酶活力單位（U）。

抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的測定參照Nakano等[23]的方法。APX粗酶液提取方法同CAT，反應體系包括4.6 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液、0.1 mL 9 mmol/L抗壞血酸、0.2 mL粗酶液和0.1 mL 3% H2O2。以每分鐘反應體系在290 nm波長處吸光度減少0.01為一個酶活力單位（U）。

以上酶活力結果以蛋白質量計，單位均為U/mg。

1.3.2.6 DPPH自由基清除率和羥自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定參照Brand-Williams等[25]的方法，并略作修改。取1 g青椒樣品，用5 mL 90%甲醇溶液進行充分研磨，12 000 r/min離心20 min后得到上清液。反應體系包括0.1 mL上清液和1.9 mL 120 μmol/L DPPH甲醇溶液，以90%甲醇溶液代替上清液作為對照，在25 ℃下避光反應30 min，測定515 nm波長處的吸光度。

羥自由基清除率的測定參照張蘭杰等[26]的方法，并略作修改。取1 g青椒樣品，用5 mL 50%乙醇溶液進行充分研磨，12 000 r/min離心20 min后得到上清液。反應體系包括0.5 mL上清液、1.5 mL 18 mmol/L水楊酸、2.0 mL 18 mmol/L FeSO4和0.3% H2O2，以50%乙醇溶液代替上清液作為對照，在37 ℃下避光反應30 min，測定510 nm波長處的吸光度。

1.3.2.7 可溶性蛋白質含量的測定

可溶性蛋白質含量的測定參照Bradford[27]的方法，以牛血清白蛋白為標準。

1.4 數據統計與分析

以上指標均重復測定3 次。采用WPS Office 2019和SAS 9.2軟件對數據進行統計與分析，采用Origin 8.0軟件作圖。數據的差異顯著性分析采用鄧肯氏多重比較法，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 高濕貯藏對青椒果實冷害指數和相對電導率的影響

圖1 高濕貯藏對青椒果實冷藏期間冷害指數（A）和相對電導率（B）的影響Fig.1 Effect of high relative humidity storage on chilling injury index (A) and relative electric conductivity (B) of green pepper fruits during cold storage

如圖1A所示，在貯藏期間，青椒果實的冷害指數隨貯藏時間的延長而不斷升高，且高濕組的冷害指數顯著低于低濕組（P＜0.05）。在青椒果實貯藏結束時，高濕組的冷害指數為37.04%，比低濕組低54.54%，這表明高濕貯藏可減輕青椒果實的冷害癥狀，延長果實貯藏壽命。相對電導率可反映果實貯藏期間細胞膜的通透性及完整性，是衡量冷害的重要指標之一。如圖1B所示，青椒果實的相對電導率在貯藏過程中呈不斷上升趨勢，但高濕組的相對電導率在6 d后顯著低于低濕組（P＜0.05），表明高濕貯藏可減輕細胞膜的損傷，維持其完整性和功能性，從而有效抑制冷害的發生。

2.2 高濕貯藏對青椒果實質量損失率和硬度的影響

如圖2A所示，低濕組青椒果實在貯藏期間，其質量損失率隨貯藏期的延長急劇上升，貯藏15 d后質量損失率達到了8.57%，青椒果面凹陷皺縮嚴重，品質下降。而高濕組青椒果實的質量損失率隨貯藏期的延長緩慢上升，貯藏15 d后質量損失率為2.24%，僅為低濕組果實的26.14%，差異顯著（P＜0.05）。硬度是衡量果實貯藏品質的重要指標之一。如圖2B所示，在整個貯藏期間，青椒果實的硬度呈不斷下降的趨勢，但高濕組較低濕組下降緩慢，且在6 d后兩組呈現出顯著差異（P＜0.05）。這些結果表明高濕貯藏可以降低青椒果實水分損失的速率，從而保持其商品性，延長貨架期。

圖2 高濕貯藏對青椒果實冷藏期間質量損失率（A）和硬度（B）的影響Fig.2 Effect of high relative humidity storage on mass loss percentage (A)and firmness (B) of green pepper fruits during cold storage

2.3 高濕貯藏對青椒果實葉綠素、抗壞血酸、總酚和總黃酮含量的影響

圖3 高濕貯藏對青椒果實冷藏期間葉綠素（A）、抗壞血酸（B）、總酚（C）、總黃酮（D）含量的影響Fig.3 Effect of high relative humidity storage on the contents of chlorophyll (A), ascorbic acid (B), total phenolics (C) and total flavonoids (D)in green pepper fruits during cold storage

如圖3A所示，在整個貯藏期內，青椒果實的葉綠素含量呈現出逐漸下降趨勢，貯藏6～9 d期間低濕組的葉綠素含量迅速下降，而高濕組下降緩慢，貯藏結束高濕組的葉綠素含量顯著高于低濕組（P＜0.05）。抗壞血酸、酚和黃酮是青椒中重要的抗氧化物質。如圖3B所示，在貯藏期間低濕組和高濕組的青椒果實抗壞血酸含量均呈下降趨勢，而低濕組的抗壞血酸含量下降得更快，幅度更大。在貯藏結束時，低濕組和高濕組的抗壞血酸含量分別為貯藏開始時的48.90%和69.29%，兩組之間差異顯著（P＜0.05）。如圖3C、D所示，在貯藏期內，青椒果實中總酚和總黃酮含量呈現出先上升后下降的趨勢，且高濕組的含量始終高于低濕組，貯藏15 d后，高濕組青椒果實的總酚和總黃酮含量與低濕組相比分別提高了17.88%和17.99%。這些結果表明，高濕貯藏可保持青椒果實較高的葉綠素、抗壞血酸、總酚和總黃酮含量，從而減輕冷害造成的品質劣變。

2.4 高濕貯藏對青椒果實抗氧化酶活力的影響

如圖4A、D所示，低濕貯藏的青椒果實在整個貯藏期內的SOD和APX活力變化幅度很小，而高濕貯藏則促進了青椒果實前期的SOD和APX活力的上升，且均在第9天達到峰值，分別是同期低濕組的1.34 倍和1.32 倍，差異顯著（P＜0.05）。如圖4B所示，青椒果實在4 ℃貯藏期間，低濕組和高濕組青椒果實CAT活力呈先上升后下降趨勢，且均在第9天達到最大值，分別為98.41 U/mg和124.93 U/mg，在峰值出現之前高濕組青椒果實的CAT活力顯著高于低濕組（P＜0.05）。如圖4C所示，高濕組青椒果實的POD活力在貯藏前期急速上升，而低濕組上升較為緩慢，兩組均在貯藏9 d時達到最大值，此時高濕組青椒果實的POD活力比低濕組高41.09%。兩組在貯藏9 d后差異顯著（P＜0.05）。這些結果表明，高濕貯藏保持了青椒果實較高的抗氧化酶活力，有利于活性氧的清除。

圖4 高濕貯藏對青椒果實冷藏期間抗氧化酶SOD（A）、CAT（B）、POD（C）和APX（D）活力的影響Fig.4 Effect of high relative humidity storage on antioxidant enzyme SOD (A), CAT (B), POD (C) and APX (D) activities in green pepper fruits during cold storage

2.5 高濕貯藏對青椒果實生成速率和H2O2含量的影響

圖5 高濕貯藏對青椒果實冷藏期間·生成速率（A）和H2O2含量（B）的影響Fig.5 Effect of high relative humidity storage on · generation rate(A) and H2O2 content (B) in green pepper fruits during cold storage

2.6 高濕貯藏對青椒果實DPPH自由基清除率和羥自由基清除率的影響

圖6 高濕貯藏對青椒果實冷藏期間DPPH自由基（A）和羥自由基（B）清除率的影響Fig.6 Effect of high relative humidity storage on DPPH radical scavenging activity (A) and hydroxy radical scavenging activity (B) in green pepper fruits during cold storage

如圖6A所示，低濕組和高濕組青椒果實的DPPH自由基清除率在貯藏期內的變化趨勢相同，均在前3 d短暫降低后升高，在第9天達到峰值，隨后又下降。貯藏結束時高濕組的DPPH自由基清除率比低濕組高71.91%，兩者差異顯著（P＜0.05）。如圖6B所示，青椒果實的羥自由基清除率在整個貯藏期間呈先上升后下降趨勢，貯藏6 d后高濕組青椒果實的羥自由基清除率顯著高于低濕組（P＜0.05）。這些結果表明，高濕貯藏可維持青椒果實較高的自由基清除能力。

3 討 論

冷藏是果蔬采后最重要的保鮮手段，但青椒是一種冷敏性果實，不適宜的低溫貯藏會造成青椒的生理代謝失調和組織傷害，即產生冷害，嚴重影響采后青椒的貯藏壽命和冷鏈流通[6]。因此，如何延緩或減輕冷害的發生是青椒果實冷鏈貯運的關鍵。本研究發現在普通低濕冷庫中貯藏的青椒果實貯藏期間冷害指數上升較快，15后表現出嚴重的果面凹陷和花萼褐變而失去商品價值。而采用干霧控濕冷庫高濕貯藏可顯著減輕果實的失水軟化及冷害癥狀，至貯藏結束時冷害指數僅為37.04%，比低濕組低54.54%。同時高濕貯藏還可維持青椒果實較高的葉綠素、抗壞血酸、總酚和總黃酮含量，從而保持較好的營養品質和商品價值。這與賈雯茹等[16]采用干霧控濕高濕冷庫貯藏減輕黃瓜果實冷害的結果相似。另外采用塑料薄膜包裝從而創造的高濕環境也可減輕番茄[9]和臍橙[10]的冷害。這些結果表明，高濕度的貯藏環境有利于減輕冷敏性果實的冷害，延長貯藏期。

抗壞血酸、酚類物質和類黃酮是青椒中重要的非酶抗氧化成分，與果實的抗冷性密切相關。CaiYuting等[28]的研究證明，茉莉酸甲酯處理可維持果實中較高的抗壞血酸含量，是減輕枇杷冷害褐變的原因之一。Lo’ay等[29]發現，外源抗壞血酸處理也可減輕香蕉的冷害褐變。孫玉潔等[30]發現甜菜堿處理能提高枇杷果實總酚和總黃酮含量，有助于清除活性氧，抑制膜脂過氧化，從而減少果實冷害的發生。在本研究中，干霧控濕高濕貯藏可提高青椒果實中抗壞血酸、總酚和總黃酮含量，保持較高的DPPH自由基和羥自由基清除率，并可顯著抑制冷害指數的上升。這些結果表明，高濕貯藏可通過維持抗氧化系統中較高的抗壞血酸、總酚、總黃酮等抗氧化物質的含量來減輕青椒果實的冷害。

SOD、CAT、POD和APX是果蔬抗氧化系統中主要的抗氧化酶。SOD通過歧化反應清除?，并生成H2O2和O2，CAT將H2O2進一步分解成H2O和O2，POD和APX則分別催化酚類物質和抗壞血酸與H2O2反應從而清除[31]。這4 種酶協同作用來維持果蔬體內活性氧代謝的平衡。當冷敏性果蔬遭受低溫脅迫后，抗氧化系統的活性下降，活性氧代謝平衡被打破，高濃度的活性氧加速膜脂中不飽和雙鍵發生過氧化作用，膜系統的結構和功能遭到破壞，從而引起膜透性的增大及細胞代謝的紊亂，最終導致冷害的發生[32-33]。已有研究表明抗氧化系統中抗氧化酶活性也與冷敏果實的抗冷性有關。如采用茉莉酸甲酯處理枇杷后可顯著提高果實體內抗氧化酶SOD、CAT和APX的活性，抑制?和H2O2的產生，減輕了果實的冷害癥狀[34]。采用外源甘氨酸甜菜堿處理可誘導青椒果實POD、CAT和APX的基因表達，提高抗氧化系統的活性，抑制了冷害的發生[6]。本研究發現，高濕貯藏能誘導SOD、CAT、POD和APX等抗氧化酶活力的增加，增強DPPH自由基和羥自由基清除率，抑制?和H2O2的積累。這些結果表明，高濕貯藏條件下較高的抗氧化酶活性可有效清除活性氧，防止其對細胞膜系統的傷害，進而減輕貯藏期間青椒果實冷害的發生。

綜上，本研究表明，干霧控濕高濕貯藏可顯著抑制青椒果實冷害指數、相對電導率和質量損失率的上升以及葉綠素、抗壞血酸、總酚和總黃酮等營養物質含量的下降，從而維持良好的采后品質。同時，高濕貯藏還可誘導抗氧化系統中SOD、CAT、POD和APX等抗氧化酶活力上升，保持較高的DPPH自由基和羥自由基清除率，從而抑制?和H2O2的積累，延緩膜脂過氧化作用，減少果實冷害的發生，因而在青椒果實冷鏈貯運中具有較好的應用前景。